研究課題
私たちは、既知・未知問わず、さまざまなテルペン酵素の生合成機能をコロニー色でスクリーニングする手法を開発してきた。本研究では、これらの手法を転用して、いままで不可視であったタンパク質・ペプチドのプレニル化活性を、ハイスループットに色スクリーニングする手法を確立することを目的としている。そして、この方法を用いて、タンパク質のプレニル化活性の強化、標的特異性の改変、さらに多様化などに挑むことも、本研究の目標である。昨年度までに開発した手法を用いて，プレニル転移酵素の高活性変異体をスクリーニング取得する努力を継続して行ったが，今なお，その努力は実っていない。そこで本年度は、改めて，変異原性ヌクレオシドのキナーゼ酵素を用いるスクリーニング系を改めて開発し直すこととした。人工ヌクレオシドdPの培地添加によって引き起こす細胞死から，プレニル化によるキナーゼの不溶化が宿主細胞をレスキューするという仕組みである。この選択作業に必要なdPの濃度（100 nM）は宿主内の変異頻度を有意に増大させることがわかったため、文献から関与しそうな遺伝子を洗い出し、それら遺伝子の過剰発現および欠損株解析を行った。その結果，外膜トランスポーターTsx、内膜トランスポーターNupC，キナーゼNdkの共過剰発現によって、一桁低いdPの添加でも再現性高い選抜実験ができること，そしてこの操作では，細胞の突然変異頻度は変化しないことが明らかになった。本研究の最終目標には未だ至っていないが，この系を使ったスループット高いポジティブ選抜法によって，プレニル化活性の高い変異体取得をこれからも目指して行く予定である。
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Biosci. Biochem. Bioeng.
巻: 82 ページ: 未定
