| 研究課題/領域番号 |
15K14231
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
小笠原 渉 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (40292172)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | スクリーニング / 1細胞分離 |
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| 研究実績の概要 |
ハイスループット培養系で環境微微生物を培養するために、1細胞を分離した後に培養すると共に、選択方法（スクリーニング方法）を確立する必要がある。昨年度までに比較的難易度が低い「核微生物の一細胞スクリーニング系」に成功したために、本年度は、「モデル原核微生物の一細胞分離と培養」および「環境微生物の分離と培養」を行った。
近年、water-in-oilエマルションを用いた微生物培養法が注目を浴びている。本培養法には、オイルで区切られた数万単位の微小区画「ドロップレット」を扱えること、ハイスループットであることおよびガス透過性が高い等の利点がある。しかし、微生物が単離されたドロップレットの形成から培養、解析までのメソッドが確立されておらず、あまり普及していない。しかしながら、本法の確立は本研究課題の目的である「環境微生物の単離培養」に寄与するため、本法の確立を試みた。
まず、界面活性剤、オイルの種類、培地成分やドロップレット形成条件の検討を試みた。その結果、直径30～100 μm程度の安定的なドロップレットを形成することに成功した。続いて、モデル微生物である偏性好気性細菌Pseudoxanthomonas mexicanaを含むドロップレット形成と培養に成功した。モデル微生物のドロップレット形成と培養に成功したため、次に実際の環境微生物解析を試みた。まず、土壌等から採取したサンプルから微生物を抽出し、ドロップレット形成と培養を試みた。培養に従いドロップレットの崩壊する等の問題が生じたが、条件検討によりこの問題の克服に成功した。さらに、ドロップレットに含まれる菌叢からDNAを抽出し、次世代シークエンサーによって解析することで、菌叢解析に成功した。これによりサンプルの採取場所や培養条件や、ドロップレット形成条件による菌叢の際を明らかにできた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度までに、油脂生産酵母や真核微生物をモデル生物として、微生物の単離スクリーニング方法の確立と、環境微生物の菌叢解析に成功している。
本申請のハイスループット培養系では、ナノ加工技術を用いた表面加工によりロータス効果（蓮の葉の粗撥水性）およびペタル効果（バラの花の親水性）が応用された培養プレートを用いる。この二種類の表面加工を施した培養プレート上に、ドロップ状の培地を設置して気相培養を行うことで、好気性微生物の培養を実現させる。ロータス効果とペタル効果の再現に技術的な課題があるため、培養プレートの試作が遅延している。本研究課題の最終目的は、環境微生物の単離培養である。そこで、近年発展の兆しを見せている「water-in-oilエマルション」を用いてドロップ状培地の培養を試みた。これにより、モデル好気性微生物の単離培養や、環境微生物の培養と菌叢解析に成功した。この培養法の成果は本申請のハイスループット培養系に応用可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）培養プレート上におけるロータス効果とペタル効果の再現。ナノ加工技術を駆使してロータス効果とペタル効果を最大限かつ安定的に再現し、微生物を培養可能な培養プレートの開発を目指す。
（２）ドロップ状培地の安定的な培養方法の確立。培養プレートの開発に平行して、既存の疎水性素材を用いてドロップ状培地の安定的な培養方法の確立を目指す。
（３）モデル微生物の培養法の検討と蛍光基質を用いたペプチダーゼ活性スクリーニング系の確立。本項目では、（１）と（２）で構築できた培養プレートでの培養とスクリーニングを試みる。（１）と（２）が達成できなかった場合を考慮し、エマルション培養系でも本項目を実施する。培養方法については、モデル微生物を用いて培地組成、培養条件および時間など検討する。本項目により環境微生物の培養条件検討に用いるためのパラメーターの範囲の目安を得る。さらに、スクリーニングに用いる蛍光基質の濃度や反応条件を、活性の検出や微生物の成育に与える影響の観点から調査する。
（４）環境微生物の分離とスクリーニング。（３）で得られたパラメーターを活用しながら、環境微生物の分とスクリーニングを試みる。
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