| 研究課題/領域番号 |
15K14237
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
飛松 孝正 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (30188768)
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| 研究分担者 |
森 光一 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (50379715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | pduオルガネラ / 多面体オルガネラ / ジオールデヒドラターゼ / プロパンジオール資化 |
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| 研究実績の概要 |
原核生物の中には百ナノ程度のカプシド様のタンパク性多面体オルガネラをもつものがいる。このオルガネラには特定の代謝酵素群が詰込まれ、代謝中間体の希釈を防いで、効率よく代謝反応を進めている。このオルガネラを新たなバイオリアクターとして用いるために研究を進めているが、そのためには、まずオルガネラの形成機構を知ることが必要である。本研究では、まずオルガネラ内在酵素間の相互作用部位を明らかし、更にその結果を応用して他の酵素群を詰め込むことで、バイオ・ナノ反応器への道を拓くことを目的として進めている。
昨年度は、まずクレブシラオキシトカpduオルガネラの殻タンパク質遺伝子（pduABJKMNTU）の発現系の構築を行ない、大腸菌で大量発現させた。本年度はこの発現系からの殻多面体オルガネラの精製法を検討した。すでにpduオルガネラの精製法が確立しているサルモネラの遠心分離法を用いる精製法を試したところ、pduオルガネラが沈殿しないはずの3,300×gで、発現した殻タンパク質のほとんどが沈殿した。大腸菌での発現条件や細胞の破砕条件等を種々検討したものの、同じ結果であった。これらの結果は封入体の形成やPduAやPduBの発現で見られる巨大自己集合体の形成を示唆していたので、クレブシラオキシトカの代わりに精製法が報告されているサルモネラを用いることにした。ゲノムDNAを鋳型にしてpduオルガネラ殻遺伝子群をPCR法によりクローン化してpduABJKMNTU遺伝子の発現系を構築した。これを大腸菌に導入して大量発現させて得られた細胞破砕液を遠心分離したところ、文献と同じ12,000-20,000×gでの沈殿画分にオルガネラ殻遺伝子産物が得られたことより、殻多面体オルガネラが形成されたものと考えられた。今後、オルガネラの分離精製法を確立して次のステップに進めたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
前年度までにクレブシラオキシトカのpduオルガネラの殻タンパク質の発現系の構築および発現はできたものの、本年度に精製法の検討をしたところ、発現した殻タンパク質は低い遠心力で沈殿していたことから、封入体または巨大複合体を形成している、つまり殻オルガネラを形成していないと考えられた。
そこで、振出しに戻るが、本pduオルガネラの性質の解明が最も進んでいるサルモネラ遺伝子を用いることに方針変更した。サルモネラゲノムから遺伝子をクローン化して大腸菌に大量発現させると、オルガネラ殻遺伝子産物が文献と同じ12,000-20,000×gでの沈殿画分に得られたことより、大腸菌でオルガネラが形成したものと考えられる。しかしながら現状は計画よりも1年遅れている。これが現在の「遅れている」の自己評価に至った理由である。
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| 今後の研究の推進方策 |
サルモネラpduオルガネラへの酵素タンパク質の組込みを確認するためにも組換え体オルガネラの精製方法を確立したい。精製法が確立できれば、オルガネラ移行シグナルを付加した標的の組込み酵素を共発現させて、組込みの効率等を明らかにする。
次に、DDのβサブユニットとγサブユニットのN末端領域の相互作用を用いれば、複数種類の酵素をオルガネラに組み込むことができるのかも試したい。特に、今回の組込み目標である、ラジカル酵素やグリセロールっデヒドラターゼの組込みも実行に移したい。
更に、pduオルガネラ酵素間の相互作用部位を明らかにすることで、組込みに使用できるシグナル配列の種類を増やしたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額（B-A）の93,952円が残った理由は次の理由である。
年度末や次年度開始時の実験実施に際して、他の試薬や器具の購入が必要になる可能性があったので、その場合に備えたものである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究遂行のために必要な試薬や器具の購入に用いる予定である。
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