| 研究課題/領域番号 |
15K14237
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
飛松 孝正 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (30188768)
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| 研究分担者 |
森 光一 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (50379715)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | pduオルガネラ / 多面体オルガネラ |
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| 研究実績の概要 |
原核生物の中には百ナノ程度のカプシド様のタンパク性多面体オルガネラをもつものがいる。このオルガネラには特定の代謝酵素群が詰込まれ、代謝中間体の希釈を防いで、効率よく代謝反応を進めている。このオルガネラを新たなバイオリアクターとして用いるために研究を進めているが、そのためには、まずオルガネラの形成機構を知ることが必要である。本研究では、まずオルガネラ内在酵素間の相互作用部位を明らかし、更にその結果を応用して他の酵素群を詰め込むことで、バイオ・ナノ反応器への道を拓くことを目的として進めている。
昨年度は、pduオルガネラの殻タンパク質遺伝子（pduABJKMNTU）をクレブシラからサルモネラに変更することで、大腸菌で大量発現させると文献と同じ12,000-20,000×gでの遠心沈殿画分に得らることを確認した。今年度は、まず、発現したオルガネラへの外来酵素の組み込みを確認する実験を行った。組み込みの確認は、外来酵素に細胞質プロテアーゼの分解シグナルであるSsrAタグを付加してもオルガネラ内部に組み込まれれば消化されないことを利用した。組み込む酵素として大腸菌細胞質酵素のイソクエン酸脱水素酵素（ICDH）を選び、オルガネラ移行シグナルとSsrAタグとを付加して共発現させて、細胞質画分とオルガネラ画分中のICDHの分解状況を観察した。大腸菌の培養条件を種々検討したものの、オルガネラ画分に存在するICDH のみが細胞質プロテアーゼによる分解から保護されていることを明確に示す結果が得られなかった。
そこで、実験のポジティブコントロールに用いる目的で、サルモネラのpduオペロン遺伝子のクローニングと大腸菌での発現系の作成を進めているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
クレブシラのpduオルガネラの殻タンパク質の発現でオルガネラ形成が認められなかったことで、計画通りの研究ができていない。つまり、用いるpduオルガネラ遺伝子をサルモネラ遺伝子に変更した時点で1年以上の遅れであり、その遅れをこれまでに取り戻すことができていない。
これが現在の「遅れている」の自己評価に至った理由である。
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| 今後の研究の推進方策 |
サルモネラpduオペロンを大腸菌で発現させて、大腸菌で発現させた組換え体オルガネラの精製方法を確立したい。それと並行して、オルガネラ移行シグナルを付加した標的の組込み酵素を共発現させて、組込みの効率等を明らかにする。
次に、DDのβサブユニットとγサブユニットのN末端領域の相互作用を用いれば、複数種類の酵素をオルガネラに組み込むことができるのかも試したい。それらを達成して今回の組込み目標である、ラジカル酵素やグリセロールデヒドラターゼの組込みの実行にたどりつきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額（B-A）の585,672円が残った理由は次の理由である。
本来今年度までが研究期間であったが、予定していた通りに研究が進展しなかったためである。研究に遅れがあったので、研究期間を延長している。残額は本年度の研究遂行のために必要な試薬や器具の購入に用いる予定である。
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