| 研究課題/領域番号 |
15K14241
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
横田 亜紀子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (20415764)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Toxin-Antitoxinシステム / 特異的認識配列 / 蛋白質-核酸相互作用 / バイオテクノロジー / 抗生物質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、原核生物におけるプログラム細胞死を担うToxin-Antitoxin (TA)システムのうち、RNAを標的とし、特異的なRNAを切断するtoxin（RNA interferase）と、その標的RNAならびにantitoxinの相互作用に焦点を当て、それらの分子認識機構を原子レベルで考察し、獲得した知見を、核酸編集技術・細胞応答制御に応用することを目的とする。
当該年度においては、難培養微生物である硝化細菌Nitrosomonas europaeaの染色体上に存在する遺伝子座(NE1181)がコードするtoxinタンパク質MazF(NE1181)が、RNA配列AAUを特異的に認識・切断すること、そしてペアであるantitoxinタンパク質MazE(NE1182)共存下において、そのRNA切断活性（毒性）が抑制されること、を明らかにした。今後もこのような難培養微生物のTAシステムについて検証を重ね、毒性活性の抑制（TAシステムの制御）に関する知見を蓄積することで、これまでは未利用であった有用な難培養微生物の産業応用が期待される。
さらに、複数の病原菌由来のtoxinについて、次世代シークエンサーを用いて、その特異的な認識・切断RNA配列を同定することにも成功した。それらtoxinに対するantitoxinの結合（中和化・無毒化）を阻害し、toxinを活性化させる（毒性を誘起する）細胞外致死因子候補を探索することで、新規抗生物質の開発の足がかりとなる情報の提供に貢献していく。
そして、多種多様なtoxinを取得することで、RNA interferaseライブラリーを構築し、遺伝子工学ツール（RNA制限酵素）の実現化を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初のH28年度の予定としては、H27年度に取得したtoxin（RNA interferase）に対するantitoxin分子の取得と、そのantitoxin混在下におけるtoxinのRNA切断阻害反応の検証を行い、それとともに、TAシステムと標的RNAの分子認識機構の解明、新規RNA interferaseの設計、さらに細胞外致死因子（Toxin活性化因子）の探索、を進める計画であった。
硝化細菌Nitrosomonas europaeaのtoxinタンパク質MazF（RNA interferase）や、病原菌由来認識のtoxinタンパク質など、複数のtoxinタンパク質について、認識RNA配列の同定に成功し、それらが配列特異的にRNAを切断すること、antitoxin蛋白質MazE共存下においてRNA切断活性を抑制すること、を明らかにし、TAシステムと標的RNAの分子認識機構を考察するためのデータは着実に蓄積されつつあると言える。
しかし、年度の途中で、当初は予定していなかった事態（研究代表者の長期休職）が発生したため、新規RNA interferaseの設計と細胞外致死因子（Toxin活性化因子）の探索については計画通りに進めることが出来なかった。
以上の進捗を踏まえ、（３）やや遅れている。という評価に至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進方策としては、これまでに取得したtoxin（RNA interferase）について、そのantitoxinと認識RNA配列との分子間相互作用に関して、引き続きリアルタイムPCRなどを用いた詳細な解析を進めていく。また、並行して、新しいtoxin分子についても、サンプルとデータの取得を試みる。それら一連の実験結果と、既存のTA分子と標的RNAに関するデータを融合し、必要に応じて変異解析も組み合わせることで、RNA interferaseの特異性変換、高活性化、高安定化などを試行し、新規RNA interferase の設計とRNA interferaseライブラリーの充実化を図る。
さらに、病原菌由来のtoxin - antitoxin ペアに着目し、toxinに対するantitoxinの結合（中和化・無毒化）を阻害し、toxinのRNA interferase活性を促進させうる細胞外致死因子（toxin活性化因子）の探索も試みる。それにより、将来的に抗生物質の開発につながるような病原菌に対する細胞外致死因子候補を、迅速・簡便にスクリーニングする系の構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度の途中から平成29年度の途中まで研究代表者が休職することになった。それにより、当初計画通りに研究を遂行するためには、予定を変更（期間を延長）し、当初、平成28年度に使用予定であった助成金の一部を平成29年度に持ち越して実験を行う必要が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度に実施予定であった実験を今年度に行うため、それらに必要な試薬や器具類の購入に使用する予定である。また、当初は想定していなかった事情により、申請者の実験時間が制限されることになったため、計画通りに課題を遂行するためには実験補助者が必要と判断し、助成金の一部は人件費（実験補助者の雇用）に使用する予定である。
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