| 研究課題/領域番号 |
15K14319
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
森 泰丈 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (00343252)
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| 研究分担者 |
岡 雄一郎 大阪大学, 連合小児発達学研究科, 講師 (30614432)
猪口 徳一 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60509305)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 翻訳 / messenger RNA / 翻訳停止因子 / リアルタイム解析 / 可視化 |
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| 研究実績の概要 |
リアルタイムに細胞内における局所的な翻訳の変動を可視化するシステムの構築を目指し、翻訳停止時に起きる分子間反応をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)により検出する系の開発をを試みた。beta-actin ｍRNAは神経細胞において樹状突起にも局在し、シナプス伝達強度に応じて局所的に翻訳される。そこで、beta-actin mRNAの終止コドンの3'側ににMS2 binding site (MS2-BD)を挿入したmRNAを初代培養ニューロンに発現させ、MS2とYFPを融合したUPF1タンパク質を結合させた。これによりbeta-actin mRNAは蛍光タンパク質YFPにより標識された。このニューロンにUPF1タンパク質と結合する翻訳停止因子であるeRF3にCFPを融合したタンパク質を発現させた。前年度はλNとBoxB配列を用いてbeta-actin mRNAにUPF1タンパク質を結合させたが、本年度はMS2とその結合配列を用いたシステムを構築し、FRETが観察できることを確認した。さらに終止コドンをアミノ酸に置き換えることにより、終止コドンとそれに続くMS2-BDをペプチドに翻訳する変異型betactin mRNAを線維芽細胞に発現すると、FRET反応が検出できないことを確認した。これによりFRET反応が翻訳特異的に起きていることを確認することができた。またBDNFなどの刺激に応じてFRET反応が大きくなり、cyclohexamideなどの翻訳を停止させる薬剤によりFRET反応が低下することをニューロンにおいて確認した。以上より、翻訳反応に同期した検出系を完成させることができた。
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