| 研究課題/領域番号 |
15K14324
|
|---|
| 研究機関 | 生理学研究所 |
|---|
研究代表者 |
川口 泰雄 生理学研究所, 基盤神経科学研究領域, 教授 (40169694)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 新皮質 / シナプス構造 / 走査型電子顕微鏡 / 光顕電顕相関 |
|---|
| 研究実績の概要 |
光学顕微鏡・電子顕微鏡観察のシームレス化によって、錐体細胞へのシナプス結合様式・微細構造を定量化することを目指して、以下の二つの実験を進めた。(1) 新皮質の脳切片標本を使った非錐体細胞と錐体細胞からの同時記録で、抑制性結合を確認できたペアーを細胞内染色し、電顕観察用に包埋した。光学顕微鏡で非錐体細胞軸索と錐体細胞樹状突起を再構築して、軸索・樹状突起コンタクト部位を同定した、各コンタクト部位近傍の樹状突起から超薄切片を作成し、透過型電子顕微鏡からの連続像を重ねることで立体再構築し、樹状突起形態やシナプス微細構造に関する、定量的形態パラメーターを取得する方法を確立した。抑制細胞の軸索終末が作るシナプス構造と、シナプス後部の樹状突起の大きさには相関があることが分かった。(2) 光顕・電顕像対応法の一つとして、共焦点顕微鏡観察とダイヤモンド切削型走査電子顕微鏡(3D-SEM)観察をつなぐための試料作成を行った。投射先を同定した新皮質錐体細胞に色素を注入して、共焦点蛍光顕微鏡で樹状突起全体像をニューロルシーダを使って再構築して、局所的にスパイン分布を定量化した。免疫組織化学で錐体細胞をDABで発色した後、3D-SEM観察用にエポン包埋した。蛍光観察像とDAB像との対応をとり、3D-SEM観察する樹状突起部位を同定し、連続電顕像を取り込んだ。3D-SEM観察を行ったところ、観察時の電荷蓄積による解像度の低下することがわかり、その改善を試みた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
生理記録した錐体細胞の特定の樹状突起のシナプス結合部位からの超薄連続切片を電顕観察して、そのシナプス微細構造を再構築することで、生理的特性との関連を調べることが可能になった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
シナプス入力タイプを蛍光免疫組織化学で同定した錐体細胞樹状突起部位から、ダイヤモンドナイフ切削型走査電顕を使って連続像を取り込み、その再構築像と蛍光像との対応がとれるようにする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
ダイヤモンド切削型走査電子顕微鏡観察において電荷蓄積による解像度の低下のために、電顕像再構築の作業が遅れたことによる。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
走査電顕像の再構築作業や、その次に予定している免疫組織化学と走査電顕観察を組み合わせる実験に用いる。
|
