ゲノム編集ツールを用いたオンデマンド変異動物作製法の開発

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14366
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 藤原 祥高 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (70578848)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / CRISPR/Casシステム / 遺伝子組換えマウス / ES細胞 / ノックイン / 点変異

研究実績の概要

生命科学研究の発展において、個体レベルでの遺伝子機能解析が果たしてきた役割は大きい。近年報告された次世代のゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムは、従来法に比べて、非常に簡便かつ高効率に遺伝子改変動物を作製することができる。本課題では、単純な遺伝子破壊（KO）ではなく、点変異やノックインなどのより高度なゲノム編集を試み、CRISPR/Cas9システムを使ったオンデマンド変異動物作製法の構築を目指した。

われわれは以前に、sgRNA/CAS9共発現プラスミドDNAを環状のまま受精卵へ注入することで、効率良くKOマウスを作製できることを報告した（Sci Rep. 2013, Dev Growth Differ. 2014）。まず始めに、同様の方法で点変異およびノックインマウスの作製を試みた。その結果、点変異（一本鎖オリゴDNA導入）やタグ（二本鎖DNA導入）などの0.1kb以下のノックインは効率良く導入できたが、GFPなどの1kb程度の発現カセットのノックインは、ほとんどのケースでうまくいかなかった。つまり、受精卵注入法でのノックイン効率は、導入カセットの大きさに依存して低下することが分かった。

そこで、ゲノム編集効率が高いと報告されているマウスES細胞を使って、点変異やノックインを試みたところ、受精卵注入法とは異なる結果が得られた。つまり、一本鎖オリゴDNAよりも二本鎖DNAの方が、はるかに効率良く目的変異を導入することができた。さらに、従来のターゲティングベクターの相同領域は、両腕とも5kb程度必要であったが、CRISPR/Cas9システムを使ってES細胞へ変異導入する際はそれぞれ0.5～1.0kbで十分であることも分かった。

研究成果

• [雑誌論文] Lentiviral Vector-Mediated Complementation Restored Fetal Viability but Not Placental Hyperplasia in Plac1-Deficient Mice (2016)
  • 著者名/発表者名: Muto M, Fujihara Y, Tobita T, Kiyozumi D, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biology of Reproduction 巻: 94 ページ: 6
  • DOI: 10.1095/biolreprod.115.133454
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sperm calcineurin inhibition prevents mouse fertility with implications for male contraceptive (2015)
  • 著者名/発表者名: Miyata H, Satouh Y, Mashiko D, Muto M, Nozawa K, Shiba K, Fujihara Y, Isotani A, Inaba K, Ikawa M.
  • 雑誌名: Science 巻: 350 ページ: 442-445
  • DOI: 10.1126/science.aad0836
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calreticulin is required for development of the cumulus oocyte complex and female fertility (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokuhiro K, Satouh Y, Nozawa K, Isotani A, Fujihara Y, Hirashima Y, Matsumura H, Takumi K, Miyano T, Okabe M, Benham AM, Ikawa M.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 14254
  • DOI: 10.1038/srep14254
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Double strand break repair by capture of retrotransposon sequences and reverse-transcribed spliced mRNA sequences in mouse zygotes (2015)
  • 著者名/発表者名: Ono R, Ishii M, Fujihara Y, Kitazawa M, Usami T, Kaneko-Ishino T, Kanno J, Ikawa M, Ishino F.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 12281
  • DOI: 10.1038/srep12281
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 第II部第3章 マウスでのゲノム編集 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、伊川正人
  • 雑誌名: ゲノム編集成功の秘訣Q＆A 巻: 1 ページ: 106-123
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, TEX101 and LY6K, is required for sperm fertilizing ability in mice (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 国際シンポジウム "生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御"
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館
  • 年月日: 2016-02-17
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的 GPI アンカータンパク質の機能解析と新規遺伝子改変マウス作製法の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、伊川正人
  • 学会等名: 神戸大学重点研究チーム「資源動物のシグナル伝達制御に関する研究」 ワークショップ 「生殖細胞研究の最先端技術」
  • 発表場所: 神戸大学農学研究科
  • 年月日: 2015-09-11
  • 招待講演
• [学会発表] GPI-anchored protein complex, LY6K/TEX101, is required for sperm fertilizing ability in mice (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshitaka Fujihara, Masaru Okabe, Masahito Ikawa
  • 学会等名: 第10回研究所ネットワーク国際シンポジウム
  • 発表場所: 北海道大学遺伝子病制御研究所
  • 年月日: 2015-07-23 – 2015-07-24
  • 国際学会
• [学会発表] 雄性生殖細胞特異的な発現を示すGPIアンカータンパク質複合体LY6K/TEX101の精子受精能における役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 藤原祥高、岡部勝、伊川正人
  • 学会等名: 第62回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 京都テルサ
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-29
• [備考] 大阪大学 研究者総覧
  • URL: http://www.dma.jim.osaka-u.ac.jp/view?l=ja&u=6639
• [備考] 大阪大学微生物病研究所 遺伝子機能解析分野 メンバー紹介ページ
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/information/yoshitaka_fujihara.html