| 研究課題/領域番号 |
15K14371
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
大塚 正人 東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)
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| 研究分担者 |
和田 健太 東京農業大学, 生物産業学部, 准教授 (20508113)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / マウス / 白内障 / CRISPR/Cas9 / piggyBac |
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| 研究実績の概要 |
前年度までに、妊娠雌マウスの卵管にRNAを注入し、エレクトロポレーション処理する（GONAD法）ことにより、卵管内に存在する２細胞期胚にRNAを導入してゲノム編集を行うことが可能であることを示した。しかしながら、この時点では着床前胚の結果のみしか得られていなかったため、平成27年度は本手法にてゲノム編集着床後胚、およびマウス個体を得ることを目指した。また、最適条件の検討と標準プロトコル作成も進めた。
まず、２細胞期胚である1.5日胚の受精卵（交配しプラグが確認された次の日）を含む卵管にCas9とsgRNA(eGFPに対するもの)をRNAとして導入し、エレクトロポレーションを施した。これは0.5日胚の受精卵は卵丘細胞に覆われており、核酸が受精卵に到達するための物理的障害となるためである。着床後胚（13.5～19.5日）で解析したところ、57個体回収した胚のうち14個体（25%）で遺伝子が破壊されていることを確認した。しかしながら、２細胞期胚での導入はモザイク率が高くなると考えられる。
そこで次に、卵丘細胞との接着が緩んできていると考えられる0.7日胚の受精卵に対してGONAD法を施した。この際に、白内障の原因遺伝子と考えられるFoxe3遺伝子に対するsgRNAを用いた。８個体の妊娠マウスに対して実施したところ、計36個体の仔を出産し、そのうち10個体（28%）に変異が導入されていることを確認した。これは、実用性としても十分な効率である。さらに0.7日胚で処理することは (i) 卵管内の受精卵の存在位置が限局されている（核酸溶液の注入が容易になる）、(ii) 0.7日胚は後期１細胞期胚であると考えられ、２細胞期胚である1.5日胚にGONAD処理を施す場合と比較してゲノム編集のモザイク率が低いことが期待される、と言った利点を有すると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は、GONAD法に関してこれまでの結果を論文化（Takahashi et al. Sci Rep 2015）するなど、複数の業績に繋げることができた。化学工業日報や科学新聞等にプレスリリースをしただけでなく、Nature Japanサイトでも「注目の論文」として取り上げられる（https://www.natureasia.com/ja-jp/srep/abstracts/ 66946）などの反響が大きいものであった。また、本研究を実行した高橋氏は北海道実験動物研究会で口頭発表を行い、若手優秀賞を受賞した。さらに、本手法のプロトコル論文も発表した(Gurumurthy et al. Curr Protoc Hum Genet 2016)。以上より、当初の予定よりも早く成果を上げることができたと言える。一方で、DNAベクター（piggyBacも含め）を導入してGONADを行う実験はまだ実施しておらず、その点では一部遅れている実験もある。以上のことから、概ね順調に進展しているという評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、平成27年度にGONAD法で作製したFoxe3ゲノム編集個体の変異アリルが次世代に伝播することを確認し、その効率等を検証するとともに、ホモ個体を作製するなどして実際に白内障を生じるか否かを解析し、白内障モデルマウス作製に結びつけていきたい。また、Foxe3のエンハンサー候補領域に対するGONADを施して変異体を作製し、その候補領域が実際にエンハンサーとして機能することを個体レベルで検証する。
これまではT820 エレクトロポレーター（BTX 社の20 年近く前の機器：現在入手不可）を用いてきたが、他の研究者が再現実験を行う上でも、最新機器を用いた最適化プロトコルの存在が望ましい。例えば、NEPA21（ネッパジーン）では、細胞膜に微細孔を開けるためのパルスと遺伝子を細胞内に送達させるためのパルスを個別に設定可能であり、さらに極性の切替えもできるため、細胞へのダメージを減らし且つ遺伝子導入効率を上げられるものと期待される。そこで、本機器を用いて条件検討を行う。
piggyBac トランスポゾンシステムは、piggyBac 関連核酸が導入された細胞内にて極めて高効率で目的遺伝子のゲノムへの挿入が行われる技術である。piggyBacトランスポゾンを用いてGONAD法を行い、Tgマウス作製への応用を目指す。これにより、機能獲得型の動物モデル作製も可能となる。まずは、蛍光遺伝子発現カセットを有するpiggyBac トランスポゾン（Miura et al.2013）を用いて、システムが動くか否かを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスの準備、及び維持のために、学内の支援センターを利用しており、そのための予算が必要となると考えていたが、2017年度は同様の研究テーマで学内の競争的資金を獲得できたため、一部をそちらから捻出することができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
これまでに作製したマウス、及び今後作製するマウスについて多数の個体を維持・解析する予定であり、そのために学内の支援センターを利用する。学内の研究費は2017年度で終了してしまったため、次年度は全て本科研費から支援センター利用料等を捻出する予定である。
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