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単一細胞メチローム解析は、我々が独自に開発したPBAT法を用いて複数のグループから報告がなされたが、そのデータ品質はまだまだ不十分である。我々は、ランダムプライミングに基づくPBAT法をベースに、その方法の弱点を逆に利用することによるサブシングルセル解析を提案した。
その研究を進めるうちに、従来法の弱点とされたランダムプライミングを用いずに行う新しいPBAT法の着想が得られた。この方法は、バイサルファイト変換を受けた変性ssDNAの末端にTdTで3'-アジド化ヌクレオチドを導入した後に、クリックケミストリーを用いて5'-エチニル化アダプターとトリアゾール環を介して連結させるものである。DNAポリメラーゼはトリアゾール連結を乗り越えることが報告されており、ssDNAとアダプターが化学的に連結された分子を鋳型に相補鎖を合成することが可能である。各段階の反応についての条件検討を重ねて効率の最適化を行い、この方法の原理検証に成功し、論文を作成する段階に至った。
これと平行して、上記の化学的方法の発想を一部利用しながら、更に感度の高い新しい方法の模索も続けた。その結果、ssDNA末端にTdTでリボヌクレオチドを取り込ませた上で、RNAリガーゼを用いて一本鎖DNAアダプタを連結する方法の着想を得た。この方法は、3'-OH基がRNAから提供されていれば、RNAリガーゼがDNAの5'-リン酸基との間で効率的な連結を触媒できることに基づくものである。オリゴヌクレオチドを用いたモデル実験による最適化を進めた結果、この方法の原理検証に成功した。この方法は従来のssDNA同士の連結法に比較して圧倒的に効率は高く、様々な応用の可能性もあるため、特許の出願を行った。この方法をPBAT法に応用するため、バイサルファイト処理DNAに対する条件の最適化も進めた結果、高品質の単一細胞あるいはサブ単一細胞メチローム解析のための技術基盤が整備された。
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