| 研究課題/領域番号 |
15K14423
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
桑田 文幸 日本大学, 歯学部, 特任教授 (60120440)
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| 研究分担者 |
谷口 奈央 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (60372885)
中野 善夫 日本大学, 歯学部, 教授 (80253459)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細菌叢 / 系統解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は微生物ゲノムの連続塩基配列出現頻度を利用して系統解析や菌叢解析を行うことを目的としている。昨年度までに系統解析でおおむね目標通りの進展があったので、今年度は主に菌叢解析（構成菌種の計算）を中心に研究を進めた。今年度は、まず４種の口腔内細菌の精製ゲノムDNAを混合し、人工的な環境細菌叢試料を作り、その塩基配列をMiSeqにより解析し100塩基の配列断片の集合としての結果を得た。その配列より、５塩基配列の出現頻度による菌叢構成種比率と、当該口腔内細菌種のゲノム情報を基にした塩基配列データベースに対してBlast検索による二つの方法で細菌の構成比を求めたところ、精度の高い計算結果が得られた：A. actinomycetemcomitans 32%/32%, F. nucleatum 14%/14%, P. gingivalis 0.42%/0.50%, S. mutans 4.9%/4.8%（菌種名 ５塩基連続配列に基づく解析による値／Blast検索を用いた解析による値）。
次に、種の間で変動が大きく、もっともエントロピー値の大きい５塩基配列、すなわち種の特定に対してもっとも情報量の大きい５塩基配列を10選び、同様の計算を行なった。その結果、高エントロピー項である10の５塩基配列を用いた計算で、512項全部を用いた場合とほとんど変わらない結果が得られた。計算量を大きく減らすことができた。
さらにヒト口腔内より採取した唾液中の最近由来の16S rRNA配列の解析を行なうと同時に、100bp断片のメタゲノム解析も行なった。現在、これらの口腔内サンプルを用いて本法による菌叢解析と従来法との比較を行なってその実用性について検討しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
菌叢構成種解析についてはおおむね計画通りに進んでいる。その結果をまとめた論文の投稿を準備中である。解析が一件、年度末の会計手続きのできない期間に入ってしまって解析委託が遅れたが、新年度に入ってすぐに解析を進める予定になっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、５～７塩基連続配列の特徴を使って、ゲノム中に異質な領域を見つけることで、伝播によって種が獲得した配列を網羅的に拾い上げることを中心に研究を進める。「偏り」を見つける方法として、1-class support vector machineによる予測を検討している。一般にサポートベクターマシンは集団を多クラスに選り分ける機械学習の手法だが、１クラスでは「外れ値」のようなサンプルを見出すことになる。それによって、より外れている５塩基連続配列の偏りを見出すことが可能になる。その領域を集め、相同性検索によって機能を推定することで、既知の移動性遺伝子が見出されるはずだが、そのような機能の推定ができない配列群をまとめて、さらにグループ化を行なうことにより、新たな移動性遺伝子を見出すことが可能になるかも知れない。試験的に数種の口腔内細菌で試してみたところ、Tranposaseや薬剤耐性遺伝子等を含む配列が選び出されてきて、方法として有効であることが示唆されている。
さらに、10連続以上の配列を使って種特異的配列を見出すことにより、より解像度の高い系統解析および菌叢解析の方法を開発する。15塩基になれば２～４MBの細菌ゲノム中に数個しか出現しないはずである。10～15連続塩基配列で種特異性の高い配列を見出せるかどうか、検証する。特異配列を見つけるための計算量は増えるが、種特異配列をいちど見出しておけば、それを用いた菌叢を構成する酒の割合を予測する計算量は格段に少なくなり、効率を高めることが可能になるはずである。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
DNA塩基配列の解析を新年度になってから行うことにしたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
29年度助成金と合わせて、予定していた塩基配列の解析を29年度予定分とともに進めていく。その解析に必要なサンプル調製のための消耗品（DNA精製関連）、および成果発表のための学会発表に必要な出張費やポスター作成費、論文投稿に必要な英文校閲、掲載料等に主に研究費を使用する計画となっている。
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