観るだけでわかるタンパク質間相互作用のハイスループット解析法の開発

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14456
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科, 教授 (40192679)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: タンパク質間相互作用 / GFP / Nanobody / マイクロプレート / ポリスチレン親和性タグ

研究実績の概要

本研究では、独自に開発した改変型共免疫沈降法である『観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法：visible immunoprecipitation assay（VIPアッセイ）』に関して、マイクロプレートによりアッセイが可能になるように改良するとともに、このアッセイを用いてさまざまな結合タンパク質のスクリーニングを行うことを目的とした。
まず、共免疫沈降に用いるGST融合型抗GFP-Nanobodyに関して、これまでの検討結果でもっとも吸着性の高かったポリスチレン（PS）親和性ペプチド配列をタグとして用い、PSマイクロプレートへの吸着条件、およびプレート洗浄の条件の最適化を図った。PSタグNanobodyは、BSAや界面活性剤のTween20の存在下においても、PSマイクロプレートに対して高い吸着性を示した。ただし、感度はグルタチオンセファロースビーズを用いる通常の共免疫沈降系と比べてはるかに悪かった。
そこで、抗GST抗体を二次抗体、抗ウサギIgGを三次抗体として用いてシグナルを増幅し、最終的にELISAで検出することを検討した。さまざまな比率で二次抗体と三次抗体を試し、最適の比率条件を決定した。そして、ELISAで検出することによって、高感度化に成功した。さらに、GST融合型抗GFP-Nanobody（一次抗体）、二次抗体、三次抗体の添加に関して、One-Step、Two-Step、Three-Step添加法を試し、One-Step法での高感度化を達成できた。ただし、ELISAを用いる方法ではVIPアッセイの利点（すなわち簡便であること）を十分には活かせていないことから、実用化のためには今後の検討が必要である。

研究成果

• [雑誌論文] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by the Joubert syndrome proteins ARL13B and INPP5E (2017)
  • 著者名/発表者名: Nozaki S, Katoh Y, Terada M, Michisaka S, Funabashi T, Takahashi S, Kontani K, Nakayama K
  • 雑誌名: J. Cell Sci. 巻: 130 ページ: 563-576
  • DOI: 10.1242/jcs.197004
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Intraflagellar transport-A complex mediates ciliary entry and retrograde trafficking of ciliary G protein-coupled receptors (2017)
  • 著者名/発表者名: Hirano T, Katoh Y, Nakayama K
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 ページ: 429-439
  • DOI: 10.1091/mbc.E16-11-0813
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ciliary entry of KIF17 is dependent on its binding to the IFT-B complex via IFT46-IFT56 as well as on its nuclear localization signal (2017)
  • 著者名/発表者名: Funabashi T, Katoh Y, Michisaka S, Terada M, Sugawa M, Nakayama K
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 ページ: 624-63
  • DOI: 10.1091/mbc.E16-09-0648
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system (2017)
  • 著者名/発表者名: Katoh Y, Michisaka S, Nozaki S, Funabashi T, Hirano T, Takei R, Nakayama K
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 28 ページ: 898-906
  • DOI: 10.1091/mbc.E17-01-0051
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex (2016)
  • 著者名/発表者名: Katoh Y, Terada M, Nishijima Y, Takei R, Nozaki S, Hamada H, Nakayama K
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 291 ページ: 10962-10975
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.713883
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Alteration of transbilayer phospholipid compositions is involved in cell adhesion, cell spreading, and focal adhesion formation (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyano R, Matsumoto T, Takatsu H, Nakayama K, Shin HW
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 590 ページ: 2138-2145
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12247
  • 査読あり
• [雑誌論文] The phospholipid flippase ATP9A is required for the recycling pathway from the endosomes to the plasma membrane (2016)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Ono N, Shima T, Tanaka G, Katoh Y, Nakayama K, Takatsu H, Shin HW
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 27 ページ: 3883-3893
  • DOI: 10.1091/mbc.E16-08-0586
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modulation of primary cilia length by melanin-concentrating hormone receptor 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto A, Yamato S, Katoh Y, Nakayama K, Yoshimura K, Takeda S, Kobayashi Y, Saito Y
  • 雑誌名: Cell. Signal. 巻: 28 ページ: 572-584
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • 査読あり
• [学会発表] Phospholipid flippase ATP10A, a me mber of type IV P-type ATPases, translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2016)
  • 著者名/発表者名: Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • 学会等名: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • 発表場所: San Francisco, California, USA,
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-07
  • 国際学会
• [学会発表] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by Joubert syndrome proteins Arl13b and INPP5E. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: 2016 ASCB Annu al Meeting.
  • 発表場所: San Francisco, California, USA,
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-07
  • 国際学会
• [学会発表] Arl13b-dependant localization of INPP5E within cilia maintains ciliary r etrograde protein trafficking. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nozaki, S., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27 – 2016-11-29
  • 国際学会
• [学会発表] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex rev ealed by a visible immunoprecipitation assay. (2016)
  • 著者名/発表者名: Katoh, Y., Terada, M. & Nakayama, K.
  • 学会等名: he 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Dir ections”
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27 – 2016-11-29
  • 国際学会
• [学会発表] Differential roles of KIF17 and heterotrimeric kinesin-II interacting with the IFT-B complex in biogenesis of primary cilia. (2016)
  • 著者名/発表者名: Funabashi, T., Katoh, Y. & Nakayama, K.
  • 学会等名: The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-11-27 – 2016-11-29
  • 国際学会
• [学会発表] IFT-A複合体と相互作用するC11orf74の繊毛内タンパク質輸送における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高原万梨子、平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第89回日 本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] キネシン2とIFT複合体の相互作用の様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第89回日 本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] P4-ATPaseによるリン脂質フリップが膜変形に与える影響． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高田直人、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] リン脂質フリッパーゼATP11CのPKCによる制御機構． (2016)
  • 著者名/発表者名: 高津宏之、高山真裕、中山和久、申 惠媛
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] ジュベール症候群原因遺伝子産物Arl13bによって制御される繊毛内タンパク質輸送の分子機構． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、野崎梢平、中山和久
  • 学会等名: 第 89回日本生化学会大会シンポジウム「Arfファミリー低分子量Gタンパク質群が介在する多彩な生理機能と関連疾患」
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10 – 2016-09-11
• [学会発表] 繊毛内タンパク質の輸送を担うIFT-A複合体の構築様式と機能の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10 – 2016-09-11
• [学会発表] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2-Cep19-FOPの機能の解析． (2016)
  • 著者名/発表者名: 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第15回 次 世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-09-10 – 2016-09-11
• [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-16
• [学会発表] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Aの構築様式と機能の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 平野友章、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] KIF17とIFT複合体の相互作用様式の解明と繊毛形成における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] 観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」を活用した繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-Bの構築様式の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、寺田将也、野崎梢平
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] Trafficking Machineries within Cilia: Arc hitectures and Functions of the IFT-A and IFT-B complexes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K., Katoh, Y., Terada, T., Nozaki, S., Hirano, T. & Funabashi, T.
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会シンポジウム「高次生命機能を司るメンブレ ントラフィック：分子基盤からその破綻による疾患発症の理解に向けて」
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2016-06-15
  • 招待講演
• [学会発表] 「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」の開発と繊毛内タンパク質輸送複合体 IFT-B の 構築様式の解明． (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤洋平、寺田将也、中山和久
  • 学会等名: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-05-21
• [学会発表] KIF17 と IFT 複合体の相互作用様式の解明と繊毛内輸送における役割． (2016)
  • 著者名/発表者名: 船橋輝記、加藤洋平、中山和久
  • 学会等名: 第63回日本生化学会近畿支部例会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-05-21