| 研究課題/領域番号 |
15K14463
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| 研究機関 | 首都大学東京 |
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研究代表者 |
三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
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| 研究分担者 |
白井 康仁 神戸大学, 農学研究科, 教授 (60263399)
伊藤 隆 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (80261147)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | マルチドメインタンパク質 / NMR / プロテインライゲーション / sortase |
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| 研究実績の概要 |
キナーゼの多くは、柔軟なリンカーで連結されたマルチドメインで構成される全長構造をもつ。ドメイン間の相互作用による自己阻害型から、シグナルの入力によってその阻害が外れ、活性型の立体構造（ドメイン配置）へ変化する。本研究ではドメイン間の配置とその変化（活性化）を全長のキナーゼの分子構造レベルで可視化することで、不活性型から活性化に至る制御機構を明らかにすることを目的にしている。
解析においては、全長試料を再構成するストラテジーをとり、そのため、sortaseやクリックケミストリーを用いたドメインの連結を行う。さらに、スピンラベルプローブの工夫、常磁性効果（PRE、PCS）のNMRによる観測、構造情報の取得によって、結晶化の容易でない、柔らかな全長protein kinase B,Cの立体構造（ドメイン配置）を溶液中で解析する。
現在までに、高活性型のsortras変異体の作出に成功し、この高活性型を最適な条件で使用することで高効率なライゲーションに成功した。また部位特異的修飾アミノ酸二種類の導入法を確立し、クリックケミストリーを用いて、修飾アミノ酸を用いたドメインライゲーションが可能であることを確認した。部位特的に導入した修飾アミノ酸に対して、遷移金属のキレーターであるDOTA-M8を導入して、スピンラベルが可能であることも確認できた。これにより、マルチドメインタンパク質の再構成、構造解析に向けて大きく前進した。
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