| 研究課題/領域番号 |
15K14492
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
杉浦 美羽 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (80312255)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 光合成 / 好熱性シアノバクテリア / 光化学系II / 光従属栄養 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は好熱性シアノバクテリアのゲノムにある3つの光化学系II反応中心タンパク質D1遺伝子のうち、2つを同時にノックアウトして、そこに糖を取り込む遺伝子を挿入した組換え体の作製した。１つの細胞に100コピーあるゲノムが全て置き換わった組換え体を選抜した。更に、この組換え体を宿主細胞にして、もう1つ残ったD1遺伝子を抗生物質耐性遺伝子カセットで置き換え、D1タンパク質を作ることのできない組換え体の作製を試みた。
組換え体を何とか得ることができたので、更に、培養条件を検討し、培地に必要な糖の種類、濃度、培養時の光強度などを調べた。現在のところ、最適な条件ではないが、生育可能な条件までは見つけることができた。今後、最適な条件（特に糖の濃度と光とpH)について網羅的に探索し、組換え体の光化学系IIの有無、光合成活性について調べる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定通りに進んでいる。本研究では、2回の遺伝子の組換えが必要である。これまでの経験上、組み換える順序によって目的の組換え体が得られたり得られなかったりするので、今回は、糖の取り込み遺伝子を挿入してから残ったD1遺伝子をノックアウトするアプローチと、まず1つのD1遺伝子をノックアウトしてから残りの2つの遺伝子部分に糖の取り込み遺伝子を挿入する２つのアプローチで行った。実際、得られたものは同じように糖が無ければ生育できなない性質であったが、糖の取り込み濃度に違いがあり、どちらかの組換え体に別の変異が入っている可能性がある。現在、性質について詳細に調べている途中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、得られた組換え体について、培養条件を検討した後に、光合成機能がどの程度低下したかについて調べる。更に、ノックアウトしたD1遺伝子に部位特異的変異を導入した遺伝子を再度導入し、光合成しないでも目的の光化学系II複合体が得られるかどうかを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験は順調に進んだが、当初の予定ほど数のクローンの解析をせずに組換え体が得られたために、高価な酵素の使用頻度が少なくなった。予定していなかった培養条件の検討が必要になったが、必要な試薬が酵素ほど高価でなかったために、物品費を少なくできた。また、旅費に関しては、国際学会の招待講演で先方が旅費を負担してくれたことから、支払いがなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
物品費は次年度の更なる解析に用いたい。予定では、当初の予定よりも進んだ実験（特に新たな組換え体）ができそうなので、それの選抜や解析に利用したい。
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