| 研究課題/領域番号 |
15K14518
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
森島 信裕 国立研究開発法人理化学研究所, 小林脂質生物学研究室, 専任研究員 (40182232)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 小胞体 / カルシウムストア / 筋分化 / 小胞体ストレス / STIM1 |
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| 研究実績の概要 |
１. カルシウム枯渇モニターとして用いるSTIM1タンパク質の改変
カルシウム枯渇モニターとして用いるため、小胞体膜に局在するSTIM1（stromal interaction molecule 1)タンパク質の改変を行った。STIM1 cDNAをクローン化し、塩基配列を変えることで以下の諸条件を満たす改変STIM1を作製した。
STIM1と緑色蛍光タンパク質の類縁体（AcGFP)cDNAを連結して蛍光STIM1 cDNAを作製した。AcGFPはSTIM1の細胞質ゾル側領域内に融合させることにより、STIMの膜結合、オリゴマー形成能、カルシウム結合能、他のタンパク質との相互作用に関わる領域への影響が小さくなるようにした。蛍光STIM1 cDNAを一過的に筋芽細胞株に入れて発現させ、それが小胞体に局在することを蛍光顕微鏡観察によって確認した。蛍光STIM1の発現による細胞毒性は見られず、STIM1の強制発現がカルシウム動態に大きな影響は与えていないことが示唆された。蛍光STIM1を発現している筋芽細胞株をカルシウム枯渇誘導薬剤（サプシガルジンまたはシクロピアゾン酸）で処理したところ、蛍光STIM1シグナルの集積が見られた。その結果、STIM1シグナルは小胞体膜上の広い範囲に広がるパターンからドット状または繊維状のパターンに変化した。
２. In vitro筋分化過程のライブセルイメージング 蛍光STIM1を一過的に発現させた筋芽細胞株に対して分化誘導を行い、蛍光STIM1の共焦点顕微鏡観察を行った。筋芽細胞が融合を起こす時期の前に、筋芽細胞中で蛍光STIM1シグナルのパターンが小胞体膜に沿った網状からドット状に変化することを観察し、小胞体カルシウムの枯渇現象を捉えることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１年目の達成目標であった蛍光STIM1の作製、筋芽細胞株における発現、筋分化過程におけるSTIM1の局在パターンの観察のいずれもが達成できたため、進捗状況は順調と判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り、筋芽細胞中で起こる小胞体カルシウムの枯渇がどのようなタンパク質の挙動変化によって生じるのかという点と、カルシウム枯渇が小胞体に対してどのような効果をもたらすのかという点を解析する。これらは初年度に検出した分化過程での小胞体カルシウム枯渇現象に対してそれぞれ上流、下流のイベントにあたるものであり、全体として小胞体カルシウム枯渇シグナル系の作動原理と枯渇シグナルの役割の解明に適した方向性の研究となることが期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
プラスチック器具などの消耗品にかかる物品費が使用予定よりも若干少なくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は消耗品の購入に充てるか、あるいは研究の進展につれて新たに必要となる可能性がある抗体などの試薬購入に用いる予定である。
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