ゼブラフィッシュ遺伝学とウイルスベクターを用いた神経回路トレーシング法の確立

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14523
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 日比 正彦 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 教授 (40273627)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 逆光性トレーシング / 狂犬病ウイルス / 神経回路 / 神経解剖学 / 小脳 / ゼブラフィッシュ

研究実績の概要

脊椎動物の神経回路の形成・機能を理解する上で、ゼブラフィッシュは有用なモデル動物である。ゼブラフィッシュの神経回路は、哺乳類の神経回路と類似点があるもののの、未だ神経回路構造の全貌は明らかとなっていない。本研究では、組換え狂犬病ウイルスを用いて、ゼブラフィッシュの小脳神経回路、特に小脳入力線維の解析を行った。本研究に使用する組換え狂犬病ウイルスには、ニワトリのレトロウイルスASLV由来のエンベロープタンパク質EnvAが発現しており、ゼブラフィッシュ小脳ニューロン（プルキンエ細胞および顆粒細胞）に、EnvA受容体であるTVAとmCherry融合タンパク質（TVA-mCherry）を発現させることで、組換え狂犬病ウイルスを感染させることができる。さらに、同じニューロンに狂犬病ウイルス外被糖タンパク質（G）を発現させることで、ウイルス粒子にGが組み込まれ、軸索を逆行性に輸送され、入力線維へ経シナプス的に感染し、入力線維ニューロンをGFPで標識することができる。本年度は、プルキンエ細胞特異的遺伝子aldolase Ca（aldoca）と顆粒細胞特異的遺伝子cerebellin12（cbln12）のプロモーターを用いて、TVA-mCherryおよびGを発現するトランスジェニッックゼブラフィッシュ系統を作製した。顆粒細胞にTVA-mCherryを発現するゼブラフィッシュ成魚の小脳に組換え狂犬病ウイルス液を注入したところ、GFPを発現する顆粒細胞を見出した。このことから、少なくとも組換え狂犬病ウイルスが顆粒細胞へ感染することを確認した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

組換え狂犬病ウイルスを感染させるためのトランスジェニックゼブラフィッシュの作製に、予想より時間がかかってしまった。

今後の研究の推進方策

組換え狂犬病ウイルスを感染させるゼブラフィッシュ系統は全て作製している。今後は、感染実験を行い、神経回路トレーシング法を確立するとともに、小脳顆粒細胞の入力線維を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

組換え狂犬病ウイルスを感染させるトランスジェニックゼブラフィッシュの作製はできたものの、感染実験がまだ完了していない。

次年度使用額の使用計画

感染実験を続け、小脳ニューロンの入力線維を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Evolutionary mechanisms that generate morphology and neural-circuit diversity of the cerebellum. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hibi M, Matsuda K, Takeuchi M, Shimizu T, Murakami Y.
  • 雑誌名: Development, Growth & Differentiation 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/dgd.12349
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Oncogenic role of rab escort protein 1 through EGFR and STAT3 pathway. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yun UJ, Sung JY, Park SY, Ye SK, Shim J, Lee JS, Hibi M, Bae YK, Kim YN.
  • 雑誌名: Cell Death & Disease 巻: 8 ページ: e2621
  • DOI: 10.1038/cddis.2017.50.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] REP1 inhibits FOXO3-mediated apoptosis to promote cancer cell survival. (2017)
  • 著者名/発表者名: Song KH, Woo SR, Chung JY, Lee HJ, Oh SJ, Hong SO, Shim J, Kim YN, Rho SB, Hong SM, Cho H, Hibi M, Bae DJ, Kim SY, Kim MG, Kim TW, Bae YK.
  • 雑誌名: Cell Death & Disease 巻: 8 ページ: e2536
  • DOI: 10.1038/cddis.2016.462.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Osteocrin, a peptide secreted from the heart and other tissues, contributes to cranial osteogenesis and chondrogenesis in zebrafish. (2017)
  • 著者名/発表者名: Chiba A, Watanabe-Takano H, Terai K, Fukui H, Miyazaki T, Uemura M, Hashimoto H, Hibi M, Fukuhara S, Mochizuki N.
  • 雑誌名: Development 巻: 144 ページ: 334-344
  • DOI: 10.1242/dev.143354.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Gene expression profiling of granule cells and Purkinje cells in the zebrafish cerebellum. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi M, Yamaguchi S, Sakakibara Y, Hayashi T, Matsuda K, Hara Y, Tanegashima C, Shimizu T, Kuraku S, Hibi M.
  • 雑誌名: Journal of Comparative Neurology 巻: 525 ページ: 1558-1585
  • DOI: 10.1002/cne.24114.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. (2016)
  • 著者名/発表者名: Scalise K, Shimizu T, Hibi M, Sawtell NB.
  • 雑誌名: Journal fo Neurophysiology 巻: 116 ページ: 2067-2080
  • DOI: 10.1152/jn.00042.2016.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 真骨魚類から見た小脳の進化と発生 (2016)
  • 著者名/発表者名: 日比正彦、竹内未紀、松田光司、原雄一郎、榊原考将、種子島千春、山口信悟、吉田将之、工樂樹洋、清水貴史
  • 学会等名: 日本進化学会第18回大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-08-25 – 2016-08-28
  • 招待講演
• [学会発表] Role of Contactin1 in neural network formation for motor coordination in medaka and zebrafish. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi M, Goshima A, Inoue C, Shimizu K, Kawahara A, Yoshida M, Hibi M.
  • 学会等名: 第39回日本神経科学大会
  • 発表場所: 横浜、神奈川
  • 年月日: 2016-07-20 – 2016-07-22
• [学会発表] Zebrafish cerebellar neural circuitry is involved in the classical fear conditioning. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsuda K, Yoshida M, Kawakami K, Hibi M, Shimizu T.
  • 学会等名: 第39回日本神経科学大会
  • 発表場所: 横浜、神奈川
  • 年月日: 2016-07-20 – 2016-07-22