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本研究では、細胞や組織において任意のゲノム領域における特定の転写因子の結合をin situで検出する方法論の開発を目指している。その方法は、１）任意のゲノム領域をin situ hybridization法で検出し、２）ゲノムに結合している特定の転写因子をその特異抗体によってラベルし、３）両者の近接をPLA（Proximity Ligation Assay）法によって検出するものである。これまでに１）及び２）を同時に成立させることに成功しており、今年度は実績あるモデルとしてP19細胞を使用し、Oct3/4 distal enhancerにおけるOct3/4の結合をPLA法で検出することを試みた。本実験においては、Oct3/4のクロスリンク、賦活化、hybridization、４次抗体までの使用等の様々な条件検討を行い、最終的にtyramideによる増感を行った場合にのみ、PLAによるドット状のシグナルが核内に検出された。このPLAシグナルの妥当性を検討するために、Oct3/4の集積が少ないゲノム領域のプローブをネガティブコントロールとしたところPLAのシグナルが発生し、そのシグナル数はOct3/4 distal enhancerとOct3/4によるものよりも少ないが、残念ながら有意差を認めなかった。このネガティブコトロールにおけるシグナルは、１）tyramide増感によるバックグラウンド、２）ゲノム高次構造による予想外の相互作用によって生じたものであることが考えられる。本研究期間にPLAシグナルを検出するに至ったが、その妥当性の検証にはさらなるコントロール実験を行い、またtyramideによるバックグランドを抑制する工夫が必要であると考えられた。
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