次世代細胞系譜追跡法の開発による幹細胞探索

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14531
• 研究機関: 関西医科大学
• 研究代表者: 上野 博夫 関西医科大学, 医学部, 教授 (60332368)
• 研究分担者: 厚海 奈穂 関西医科大学, 医学部, 研究員 (90612151)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 幹細胞 / 発生

研究実績の概要

初年度の研究によって、①２種類のマーカー遺伝子共陽性細胞を特異的に標識するレポーターコンストラクトを作製した。このコンストラクトをRosa26tkneoベクターに組み込み、コンストラクトが機能することをCos7細胞に一過性発現することで確認した。またこのコンストラクトをR1 ES細胞のRosa26領域にノックインしたクローンを得た。 ②GFP, mCerulean, mOrange, mCherryに加えmKeima有する5色レインボーコンストラクトを作成した。このコンストラクトをRosa26tkneoベクターにノックインしたR1 ES細胞を得た。当初の予定ではこのコンストラクトをRosa26領域を含むBACクローンに挿入しBACトランスジェニックマウスを得る予定であったが、この方法が機能しなかったため、方針を転換し、同じコンストラクトを、制限酵素サイトを利用して２つ、ないし３つ直列に結合したコンストラクトを構築し、全体をRosa26tkneoベクターに組み込んだコンストラクトを作成した。これをR1 ES細胞のRosa26領域にノックインし、個体化すればそれぞれ１５色、ないし３５色レポーターマウスとなる。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本学動物実験施設にて感染事故が起こり、約6ヶ月に渡り実験マウスの使用が制限されたことにより、作成したコンストラクトの個体化の部分に遅れが生じている。しかしコンストラクトの作成自体はほぼ順調であり、予定通りに進行している。

今後の研究の推進方策

本学動物実験施設の感染事故は既に終息し、実験マウスを用いた研究を実施できる体制を再構築したため、平成２７年度に作成したレポーターマウスのコンストラクトをES細胞にノックインし、得られたクローンをC57/BL6マウス由来の胚盤胞に注入し、偽妊娠マウスの子宮に移植することでキメラマウスを得、このキメラマウスをC57/BL6マウスと交配することで個体化する。樹立したレポーターマウスをRosa26-CreERT2マウス, Rosa26-Flpeマウスなどと交配し、コンストラクトが個体レベルにて機能する事を証明する。

次年度使用額が生じた理由

平成26年７月に関西医科大学動物実験施設にて研究代表者グループの飼育するSPFマウスの飼育室にて他室から伝搬した消化管原虫の感染事故が発生し、新規マウス作成に関わる実験が中断した。当該SPFマウス室のマウスの殺処分、飼育室の消毒過程を経て平成26年12月より順次研究に必要なマウスの再立ち上げを施行中であり、その後は順調に推移している。しかし５ヶ月の飼育室使用中断とマウスの再立ち上げなどで研究計画が遅れた。

次年度使用額の使用計画

上記感染事故は鎮静化し、マウス再立ち上げが順調に進んでおり、現在では研究の施行に問題は無い。平成26年度の後半に行う予定であった、作成したベクターをノックインしたES細胞の個体化作業から順次進行中である。

研究成果

• [雑誌論文] Lingual Epithelial Stem Cells and Organoid Culture of Them (2016)
  • 著者名/発表者名: Hisha H, Tanaka T, Ueno H
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 17 ページ: 168－179
  • DOI: doi:10.3390/ijms17020168
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Maintenance of sweat glands by stem cells located in the acral epithelium (2015)
  • 著者名/発表者名: Shuichi Ohe, Toshihiro Tanaka, Hirotsugu Yanai, Yoshihiro Komai, Taichi Omachi, Shohei Kanno, Kiyomichi Tanaka, Kazuhiko Ishigaki, Kazuho Saiga, Naohiro Nakamura, Haruyuki Ohsugi, Yoko Tokuyama, Naho Atsumi, Hiroko Hisha, Naoko Yoshida, Keiki Kumano, Fumikazu Yamazaki, Hiroyuki Okamoto, Ueno H.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 3 ページ: 333–338
  • DOI: doi:10.1016/j.bbrc.2015.09.022
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intracellular signals of lung cancer cells as possible therapeutic targets (2015)
  • 著者名/発表者名: Tanaka K, Kumano K, and Ueno H
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 106 ページ: 489–496
  • DOI: doi: 10.1111/cas.12643
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 多色細胞系譜追跡法による幹細胞・発生研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 上野博夫
  • 学会等名: 第15回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場
  • 年月日: 2016-03-17
  • 招待講演
• [学会発表] Identification of novel stem cells by the multicolor lineage tracing method (2015)
  • 著者名/発表者名: 上野博夫
  • 学会等名: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-04
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Indentification of normal and cancer stem cells and their niche (2015)
  • 著者名/発表者名: 上野博夫
  • 学会等名: 第74回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場
  • 年月日: 2015-10-08
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 新規成体幹細胞の同定とがん化における細胞動態解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 上野博夫
  • 学会等名: 第104回 日本病理学会総会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場
  • 年月日: 2015-05-01
  • 招待講演