| 研究課題/領域番号 |
15K14535
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
近藤 武史 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 客員研究員 (60565084)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | １細胞RNA-seq / ショウジョウバエ / 上皮形態形成 |
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| 研究実績の概要 |
動物においては、一層の細胞シートからなる上皮組織が秩序だって成長と変形を繰り返すことにより機能的な器官、さらには個体を作り上げていく。上皮形態形成は異なる運命を持つ細胞群が接する境界で顕著に駆動されることから、細胞が近隣細胞との違いを認識し、応答することが必須であると考えられるが、この自他認識のメカニズムは理解が進んでいない。この形態形成運動を駆動する自他認識機構は主に発現する転写因子の違いが基盤となっていることが多い。つまり、それら転写因子群の下流で制御されるトランスクリプトームの違いが自他認識を担っていると考えられる。この自他認識制御メカニズムを全ゲノムレベルで明らかにするために、本研究ではショウジョウバエ胚における各細胞の遺伝子発現状態を定量解析することを目指しており、ショウジョウバエ胚から分離した細胞の１細胞RNA-seq技術を確立することを第一の目的としている。これまでにショウジョウバエ胚の細胞が想定以上に物理的な刺激に弱いことがわかり、手法の確立に時間がかかってしまっていたが、細胞分離の条件検討を重ね、かつ細胞を固定することによりフリューダイム社C1を用いた1細胞cDNA合成から次世代シーケンサーを用いたRNA-seq解析までの手法の確立に成功した。RNA-seqの結果を解析すると、ハウスキーピング遺伝子は細胞間で均一な発現を示す一方で、細胞特異的な発現を示すことが知られている遺伝子については細胞間で発現量に差が検出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ショウジョウバエ胚由来の細胞が想定以上に物理的な刺激に弱く、弱い物理刺激により細胞死を起こしてしまうことが原因で手法の確立に予想以上の時間がかかってしまっていたが、細胞を固定することによりC1における細胞の捕獲およびcDNA合成を行うことができるようになった。このような予期していなかった細胞の性質により当初の計画からは遅れが生じているが、その問題は解決でき、解析を進める準備は整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画を２９年度まで延長し、これまでに確立したショウジョウバエ胚から分離した細胞の１細胞RNA-seq技術を用いて計画していた400細胞の１細胞cDNA合成を行い、RNA-seqを進める。さらに、各細胞についてギャップ遺伝子とDV軸遺伝子、ペアルール遺伝子の発現量を指標にすることにより、各細胞の胚における位置を推定する。そして胚空間における領域間およびそれぞれの細胞間で遺伝子発現状態を比較することにより、異なる発現パターンを示す遺伝子を抽出し、ショウジョウバエ胚の形態形成を駆動するための細胞自他認識を制御する遺伝子発現組み合わせの候補を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ショウジョウバエ胚１細胞RNA-seq解析の実験系の確立に想定以上の時間を要したため。実験系は確立できており、29年度に計画の１細胞RNA-seq解析を遂行する。
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品費：分子生物学実験用試薬 250,000千円、分子生物学実験用消耗品 100,000千円、Fluidigm C1用試薬 700,000千円、 RNA-seq用試薬 500,000千円、 ショウジョウバエ飼育用品 50,000千円
旅費：国内学会参加 50,000円 x2
その他：論文発表費用 300,000円
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