| 研究課題/領域番号 |
15K14552
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
武宮 淳史 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (80448406)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | プロテオーム / シグナル伝達 / フォトトロピン / 青色光 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、青色光受容体キナーゼであるフォトトロピンの新奇リン酸化基質を同定することである。これまでにシロイヌナズナの黄化芽生えを対象としたリン酸化プロテオーム解析から、青色光・フォトトロピンに依存してリン酸化されるタンパク質を多数同定することに成功している。本年度は昨年度確立したフォトトロピンキナーゼを用いたin vitroキナーゼアッセイ系により、フォトトロピンによって直接リン酸化されるタンパク質の絞り込みを継続して行った。大腸菌の発現系を用いて組換えタンパク質を作製し、同じく大腸菌にて作製したフォトトロピンキナーゼ領域と32P-ATP存在下で反応させ、オートラジオグラフィによりリン酸化を検出した。これまでに全ての解析対象について組換えタンパク質の作製を試み、大部分のタンパク質についてはタンパク質を作製することができた。全長タンパク質の作製が困難であったものについては、リン酸化部位を含む断片タンパク質を作製し解析に用いた。その結果、フォトトロピンによってリン酸化される複数のタンパク質を同定することに成功した。さらにin vivoで検出されたリン酸化部位をアラニンに置換した変異型タンパク質を用いて同様のリン酸化アッセイを行ったところ、フォトトロピンによるリン酸化が見られないものが見出された。これらはこれまでフォトトロピンシグナル伝達への関与が全く報告されていない因子で、フォトトロピンの新奇リン酸化基質である可能性が高い。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
In vivo、in vitroにおけるリン酸化アッセイを完了し、フォトトロピンによってリン酸化されるタンパク質を複数同定することができた。これらは当初の目的であるフォトトロピンの新奇リン酸化基質である可能性が高いため。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究により見出されたフォトトロピンの新奇リン酸化基質候補について、シロイヌナズナの機能欠損変異体を用いて青色光応答を詳しく解析する。また、アミノ酸置換の手法を用いてリン酸化の機能的意義を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間内に大学のキャンパス移転と研究機関の異動があり、研究ができない期間が生じたため、試薬購入費として計上していた物品費が残った。タンパク質のリン酸化を含む生化学実験に使用する予定である。
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