| 研究課題/領域番号 |
15K14625
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
佐藤 豊 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (40345872)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | イネ / プロテオーム |
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| 研究実績の概要 |
従来のプロテオーム解析では、プロテアーゼによりペプチドに分解されやすく、かつイオン化しやすいペプチドを量が多い順番に解析するため、試料中に微量含まれる転写因子等の制御因子に関する情報はほとんど得られない。本研究代表者はイネの胚形成機構の解明に長年分子遺伝学的手法で取り組んできた。この間、転写レベルでの制御ネットワークの重要性を多数明らかにしてきた。一方、転写ネットワークの上流で何が起きているのか、全く情報が得られていない。本研究では、近年ヒトを材料に発展してきた次世代プロテオーム解析技術を導入し、これまで植物では全く手付かずの領域であった、胚形成初期に働く、転写ネットワークの上位の制御レイヤーの解明に挑む。
本申請研究は、次の三つのパートからなる。①転写因子をコードするイネESTクローンからin vitro転写/翻訳系を用いて、タンパク質合成を行う。②合成したタンパク質を用いてMRMトランジション情報を取得する。③イネの野生型胚および各種変異型胚よりLMD法により胚を切り出し、MRMトランジション情報を用いた「次世代プロテオーム」解析を行う。
今年度は、当初の予定通り、in vitro転写/翻訳に供する約200の転写因子の抽出をデータベース等を用いて行った。また、これら大量のESTクローンの転写/翻訳を効率よく行うことができることをこれまでに取得した約60のESTクローンを使って、検証した。その結果、約8割は容易にin vitro転写が行えることを確かめた。
さらに、イネ胚をLMDにより切り出す実験を繰り返し行い、受粉後3から4日目の胚については安定的に胚が切り出せることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度の実験は、概ね順調に進んだが、一方で、in vitro転写まではほとんどのESTクローンでうまくいくことが確認できたが、in vitro翻訳までは一つしか試すことができなかった。このため、やや遅れていると判断した。ただ、in vitro翻訳については、共同研究者が別プロジェクトにおいて条件検討を精力的に進めているので、おそらく大きな問題とはならない。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初約200個の転写因子をコードするイネESTクローンを農林水産省生物資源研究所との共同研究で無償提供を受けることを想定していたが、当該研究機関の再編などがあり、予定通り200クローンの無償譲渡ができなかった。平成28年度4月現在、当該研究機関の再編も一段落したことから、再度、共同研究のお願いをするとともに、対象を転写因子だけに絞らずに、手持ちのESTクローン（約70）等を利用して、研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度に大量のin vitro翻訳を行う予定であったが、実際には1クローンのみをin vitro翻訳を行った。しかも、この1クローンは共同研究者のシステムで行ったため、当初予定のin vitro翻訳にかかる消耗品等の出費をせずに済んだ。また、当初大量のin vitro転写/翻訳を研究者自身が行うのは、労力的に難しいと考え、一部を技術補助等の雇用により行うことを計画したが、in vitro翻訳をほとんど行わなかったので、この分の人件費を使わなかったため、次年度使用となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度は当初の予定通り、大量のin vitro翻訳を行う予定である。このための消耗品を購入する。また、年度途中で、in vitro翻訳作業がルーチンの実験になった段階で、短期間技術補助員を雇用し、大量に処理を行い実験の遅れを解消する予定である。
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