| 研究課題/領域番号 |
15K14630
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
野々村 賢一 国立遺伝学研究所, 実験圃場, 准教授 (10291890)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | イネ / 生殖細胞 / TRAP法 / INTACT法 |
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| 研究実績の概要 |
植物の生殖細胞発生の包括的な理解には、生殖細胞のみを正確に単離し、DNAやRNA、蛋白質の抽出に供試する技術が必要となる。そこで本課題では、イネの減数分裂期の生殖細胞を単離し、各種のゲノムワイドな解析に資する技術開発を目的とした。
当初は、マイクロマニピュレーターによる機械的な細胞単離を計画した。その後、諸般の事情から単離方法の見直しを検討し、Isolation of Nuclei Tagged in specific Cell Types (INTACT)法およびTranslating Ribosome Affinity Purification (TRAP)法のイネ生殖細胞への適用に方針変更した。両法はそれぞれ、標識した核膜蛋白質あるいはリボソーム蛋白質を目的とする細胞に特異的なプロモーターで発現させ、標識を利用して特定細胞の細胞核あるいはリボソーム結合mRNAを単離し、網羅的な遺伝子発現解析などに資する手法である。
今年度は、イネRanGAP蛋白質の核膜結合ドメイン、FLAGペプチド、そして蛍光蛋白質GFPの３者の融合遺伝子（WGF）を生殖特異的MEL1プロモーターに繋いだ融合蛋白質発現コンストラクト（gMEL1:WGF）を正常型のイネに導入した。gMEL1:WGF植物の減数分裂期の葯を用いて、WGFの細胞内局在を蛍光顕微鏡で調べたところ、期待通り減数分裂細胞でのみ核膜周縁にGFPシグナルが検出された。この植物体およびFLAG抗体を用いて生殖細胞の核単離を試みる予定であった。しかし形質転換当代（T0）の植物体のため生育が思わしくなく、また種子稔性も非常に低かったため方針を転換し、T1植物で十分な種子を得ることにした。現在T2植物を育成中であり、それら植物から減数分裂期の花が得られ次第、INTACTによる核単離に供試する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度の初めに生殖細胞の単離法の見直しを行ったこと、また今年度、形質転換植物の生育が思わしくなく、種子増殖したのちに核単離用に供試することに計画を変更したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在育成中の形質転換イネについて８月中には減数分裂期の葯を採取できる見込みである。その後、迅速に核単離を行い、蛍光顕微鏡下で生殖細胞核の濃縮の有無を確認する。同手法のイネ生殖細胞への単離は過去に報告がないため、成果は速やかに論文として公表する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度の初めに生殖細胞の単離法の見直しを行ったこと、また今年度、形質転換植物の生育が思わしくなく、種子増殖したのちに核単離用に供試することに計画を変更したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今後、葯のサンプリング及び核単離に必要な消耗品の購入を計画している。
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