| 研究課題/領域番号 |
15K14637
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
東江 栄 香川大学, 農学部, 教授 (50304879)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アイスプラント / 塩生植物 / 好塩性 / 細胞生長 |
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| 研究実績の概要 |
NaClは一般に植物に対して強い害作用を示すが、他の植物が枯死するNaCl濃度で逆に生育が促進するものがある。NaClの生育促進効果である「好塩性」の分子機構を明らかにするために、本年度は、１）アイスプラント同調培養系の確立、及び細胞分裂関連遺伝子の発現解析、２）細胞の肥大（浸透調節）に関連する遺伝子の発現解析、及び３）NaCl処理した細胞におけるATP合成能等を解析した。１）については、シロイヌナズナの細胞分裂制御遺伝子及び細胞周期のマーカー遺伝子と相同性の高いアイスプラントの塩基配列情報を取得しcDNA全長を得た。細胞周期S期におけるDNA複製を阻害する薬剤で懸濁培養細胞を処理し細胞周期を同調化させた。この細胞について細胞周期関連遺伝子のNaCl処理後の発現量を調査したところ、処理区間で明確な差異は認められなかった。そこで同調培養系の確立を目的に培養系を再検討したところ、0.2 mg/l 2,4-D を含むカルス誘導培地で培養し、500μm以下の細胞の選抜を長期間行うことで同調化に適した細胞系を確立できた。２）については、カリウムトランスポーター遺伝子（McHAK1、McHAK2、McHAK3、McHAK4、Ktm1）、カチオントランスポーター遺伝子（McHKT1）、硝酸イオントランスポーター（McNRT1）、H+-ATPase遺伝子（Vmac1）、水チャネル（アクアポリン）遺伝子（McMipC）等を調べ、100 mM NaCl処理した細胞で、カチオントランスポーター遺伝子McHKT1、液胞 H+-ATPase遺伝子Vmac1、及び液胞 Na+/H+アンチポーター遺伝子McNHX1の発現量が増加することがわかった。３）については、NaClを与えて栽培したアイスプラント葉身から単離したミトコンドリアにおけるATP合成量がNaCl処理で増加することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画に掲げていたが実施できなかった項目があった。すなわち、１）細胞の分裂をプロトプラスト化した細胞で評価すること、２）Na+及びCl-の細胞内含量及びK+含量との関連等をそれぞれの元素を特異的に染色する色素を用いて調べること、また、３）NaHCO3、Na2CO3、及びKCl等を懸濁培養に処理すること等である。しかし、これらはどちらかといえば補足的なデータであり本研究の核となる部分への影響は少ないものである。１）については、種々単離液を作製し損傷の少ないプロトプラストを得ることに成功したが、細胞塊を完全に消化することは難しく細胞数の値が安定しないこと、一連の工程が多く作業が煩雑であること等が問題となった。プロトプラストを用いる代わりに、継代を繰り返してサイズを揃えた細胞を用いることで再現性の高い値が得られ、細胞の大きさ及び細胞数がいずれもNaClによって増加することが明らかになった。２）については、同調化細胞系が得られるまでまずはそれぞれの元素の含量を把握することとした。Na+及びCl-いずれも細胞に取り込まれており、K+の取り込みがNaCl処理によって促進されることが明らかになった。また、３）については、これらの元素の添加によって変化すると予想される浸透圧の影響を排除するために、当初計画した実験系に浸透圧の影響とNaClの影響とを厳密に分けて検討する系を加えた。Na+とCl-、両元素の効果の違いはまだ不明であるが、好塩性は浸透圧の二次的な効果ではなく、NaClの直接的な作用であることを明らかにした。このように、実施できなかった項目はあるものの、他の実験との関連から検討方法を修正することで当初目的より良い成果を挙げることができた。以上のことから、当初の予定通りに進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初予想したとおり、NaClがATP合成能を向上させていることが明らかになった。今後はこの点を主体に研究を進めたい。具体的には、ATP合成に対するNaClの影響をより明確にするために、バリノマイジン、CCCP、DCCP、及びモネンシン等の薬剤をミトコンドリアに処理しATP合成能を測定して膜を介したNa+濃度勾配があるときにATPが合成されることを明確にする。またATPシンターゼ阻害剤を処理した場合のATP合成能の低下度合いから、ATPシンターゼ以外の機構でATPが合成されている確証を得たい。さらに、他種のミトコンドリアATPシンターゼ及びNa+依存性ATPシンターゼをコードする遺伝子の塩基配列情報を元にこれらの遺伝子と相同性の高いアイスプラントの遺伝子を単離し、発現解析を行う。あわせて、今回作成した同調化に適した細胞を用いた実験を行う。具体的には、アフィディコリン、あるいはリン酸及びショ糖欠乏処理により細胞分裂を同調化させた細胞を用いて、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期及びＧ１期のマーカー遺伝子であるHistone H4、CDKB1;1、CDKB2;2、KRP2/ICK2等の発現を確認しながら、細胞分裂制御遺伝子（CYCA2;1、CYCB1;1、CYCB2;1、CYCD1;1、CYCD2;1、CYCD3;1、CYCD4;1、CDKA;1、ICK1、KRP3、KRP4、CKS1At、E2Fb）等の発現を調べる。さらに、本年度明らかにしたNaClによってK+の取り込みが促進されるメカニズムをそれぞれの元素特異的な染色剤、関連遺伝子の発現、細胞の浸透圧等の測定から明確にしたい。また処理により発現量の増加する遺伝子を、サブトラクティブハイブリダイゼーション法、あるいは次世代シーケンスを用いたRNAseqを用いて解析したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初購入を予定していた消耗品を他予算で購入した物品で賄うことができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品の購入にあてる。すみやかに適切に使用する。
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