| 研究課題/領域番号 |
15K14664
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
小林 括平 愛媛大学, 農学部, 准教授 (40244587)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 植物 / 葉緑体 / 遺伝子組換え / 病害応答 / 活性酸素種 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、葉緑体形質転換法を用い，感染特異的に葉緑体におけるROS消去系，あるいは循環的電子伝達系を増強し，ROSの生成を低減することによって病徴発現を制御することを目的とする．平成27年度は，(1)感染特異的PR1aプロモーター（ProPR1a）の制御下で2種類の葉緑体アスコルビン酸過酸化酵素（APX）を発現する遺伝子導入タバコ（Tgタバコ）の作出と特徴付け，(2) ProPR1a制御下で葉緑体局在型T7 RNAポリメラーゼ(T7Rp)を発現するTgタバコの作出と特徴付け，(3) APXをT7プロモーターの制御下に発現する葉緑体形質転換体の作出と特徴付け，および(4)フェレドキシンをT7プロモーターの制御下に発現する葉緑体形質転換ベクターの構築およびタバコへの導入に取り組んだ．
(1)については，チラコイド膜局在型（tAPX）およびストロマ局在型（sAPX），および対照としてGFP遺伝子をそれぞれProPR1aの支配下でタバコに導入し，それぞれ6，1，および8系統のTgタバコを得た．サリチル酸(SA)処理による導入遺伝子の発現を検討したところ，EGFPでのみ顕著な発現誘導が認められた．また，これらTgタバコにTMVおよびCMV感染させたところ，病徴発現およびウイルス増殖に導入遺伝子間での差異は認められなかった．また，(2)においても，T7Rpを葉緑体に移行させる目的でRubisco小サブユニットのトランジットペプチド(TP)を用い，一過性発現および安定形質転換体におけるT7Rpの発現をウェスタンブロッティングで検討したが，発現を確認するには至らなかった．これらの結果からProPR1aを用いて葉緑体タンパク質を発現させることが困難であることが示された．また，外来タンパク質を葉緑体に移行させるのに用いるTPについてEGFPとT7Rpを用いて検討したところ，フェレドキシン由来のTPがもっと効率が良く，一過性発現におけるT7Rpの発現を確認した．(3)ではtAPXおよびsAPXの各4系統で遺伝子導入を確認した．(4)では薬剤耐性シュートを得た．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
葉緑体へのタンパク質の移行はトランジットペプチド(TP)によって支配され，外来タンパク質遺伝子にTP領域の配列を融合することによって，外来タンパク質を効率的に葉緑体に移行させることができることはよく知られている．本研究代表者においても数種類のTPをGFPに融合させることによって，葉緑体に効率よくGFPを局在させることができるのを確認していた．また，T7 RNAポリメラーゼ(T7Rp)を葉緑体で発現させるのに本研究と同様にRubiscoのTPを用いた先行研究もある．それゆえ本研究計画におけるT7Rp発現も何ら問題なく行うことができると考えていた．また，感染特異的PR1aプロモーター（ProPR1a）の制御下でタバコに導入したGFP遺伝子がウイルス感染に応答して発現したことから，転写誘導の段階にも何ら問題はないと考えられた．しかし，ProPR1a::Rubisco-TP::T7RpではT7Rpタンパク質の発現はおろか，T7Rp mRNAの発現誘導もほとんど観察されなかった．翻訳産物の局在性を検討する目的で作成したProPR1a::Rubisco-TP::GFPにおいても同様であった．そこで種々のTPをGFPに融合し，一過性発現系でTPの性能を評価する必要が生じた．最終的にフェレドキシンのTPを用いることでT7Rpの発現を確認することができたが，これらの予定外の検討が必要になったため計画に遅延が生じた．
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のようにフェレドキシンのTPを融合することでT7Rpの発現を確認し，技術的な問題を解決することができた．今後は当初計画に従って，研究を進める．また，これまでに上述のT7Rpをはじめ，TPを持つ葉緑体タンパク質遺伝子を種々の感染特異的PR1aプロモーターを用いて発現させようとしたが，いずれも失敗に終わっている．その原因として，転写プロモーターが翻訳後のタンパク質の輸送に直接の影響を及ぼすとは考えにくいことから，mRNAの5´非翻訳領域がmRNAの細胞内局在，翻訳効率，あるいは翻訳産物の輸送効率などに関与する可能性が考えられる．この問題は本研究課題の中心的な部分ではないが，本研究における技術開発に関連する重要な問題であるので，本課題の中でさらに追究する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
葉緑体におけるT70プロモーター・T7 RNAポリメラーゼ発現系の構築において問題が生じたため，植物の病原体接種試験に遅延が生じた．そのため，病原ウイルスの検出に用いる抗体やその他の試薬を次年度購入し，使用することとした．
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| 次年度使用額の使用計画 |
計画通り，病原ウイルスの検出に用いる抗体やその他の試薬を28年度に購入し，使用する．
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