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AGO1に取り込まれたウイルス由来のsiRNA (vsiRNA)の特異性を予測するために、引き続きAGO1-miRNAを用いて標的mRNAの認識特異性に関する検証実験を行った。ホタルルシフェラーゼ遺伝子(FLuc)を用いてNicotiana benthamianaで一過的に遺伝子発現抑制を検証する実験を行ない、FLucの3’UTRに挿入した標的配列とmiRNAの間に三つのミスマッチが生じる区を網羅的に検証した。その結果、miRNAの中央領域とシード領域の間の塩基対、及び3’ supplementary領域の塩基対が遺伝子発現抑制に重要なことが明らかとなった。2年間で完了したルシフェラーゼアッセイの結果は、AGO1-vsiRNAの標的となりうるmRNAの予測アルゴリズムの構築に活用できる実験に基づくデータとして、非常に有用である。
並行して、実際にウイルス感染時にAGO1中に取り込まれるvsiRNAを調べる目的で、N. benthamianaのAGO1 (NbAGO1)に対する抗血清を作出した。ウエスタンブロッティングによって、NbAGO1タンパク質のシングルバンドが確認されたため、抗血清がうまく作用したことが示唆された。この抗NbAGO1抗血清を用いれば、NbAGO1の免疫沈降が可能であり、NbAGO1に入りやすいvsiRNAを実験的に検証できるようになる。多犯性のCMV由来のvsiRNAが他の宿主植物でAGO1に取り込まれて働くかどうかを評価するための有用な材料となるであろう。
また、ウイルス感染時にNbAGO1の発現量が変化するかどうかを調べた結果、その発現量が上昇しないことが確認できた。ウイルス感染時に一定量のvsiRNAがAGO1中に取り込まれることを考えると、本来AGO1に取り込まれて働くはずの一部のmiRNAが働けない状況が生じている可能性が想定された。
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