| 研究課題/領域番号 |
15K14685
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
古園 さおり 東京大学, 生物生産工学研究センター, 特任准教授 (90321760)
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| 研究分担者 |
小倉 光雄 東海大学, 海洋研究所, 教授 (80204163)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アセチル化 / RNAポリメラーゼ / 枯草菌 / 転写 |
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| 研究実績の概要 |
枯草菌ECFシグマ因子の1つであるSigXが胞子形成培地へのグルコース添加により活性化される現象が見出されている。この現象にRNAポリメラーゼ（以下RNAP）のアセチル化が関与する可能性に着目して検討を進めている。前年度までに、グルコース添加条件と非添加条件での培養菌体からRNAPをアフィニティー精製し、前者のRNAPはSigX依存的転写活性がより高いこと、両者でアセチル化修飾に違いがあることを見出した。本年度は、グルコース依存的なSigX活性化に関わるアセチル化部位を見出すことを目的として、アセチル化部位に非アシル化模倣変異（KR変異）やアセチル化模倣変異（KQ変異）を導入し、sigX-lacZレポーターを用いて変異スクリーニングを行った。変異導入はシグマ因子と相互作用するβ (RpoB)及びβ’ (RpoC)サブユニットのアセチル化部位を対象に、ゲノム上のオリジナル遺伝子座において行った。35の変異株を作成して検討した結果、あるリジン残基のアセチル化模倣変異がグルコース依存的なSigX活性化を増強することを見出した。対応する非アシル化模倣変異ではそのような効果は見られなかったことから、アセチル化が関与することが示唆された。当該残基のアセチル化レベルはグルコース添加条件で増加していた。ホモロジーモデル構造を用いて構造マッピングを行ったところ、当該リジン残基はホロ酵素形成時に大きく構造変化することが知られるG-flap領域内に位置しており、この部位のアセチル化がSigXとのホロ酵素形成に影響を及ぼす可能性が考えられた。また、35のRNAP変異株のうち多くは野生型株と同等の増殖を示したが、いくつかの変異株については増殖に影響が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
グルコース依存的なSigX活性化に影響を及ぼすアセチル化部位を同定できたので、目標を概ね達成できていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
見出したアセチル化部位変異株よりRNAPを精製し、転写に与える影響をin vitroで検証する。コア酵素とSigXとの相互作用を評価する系を確立して、変異がホロ酵素形成に与える影響を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画に従い実験を進めた所、想定していない現象を発見し、解析する必要が生じた。当初想定した年度内では研究が完了しない事が明らかになったので、期間を延長し論文発表等の成果につなげたい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
オリゴDNA購入費として177424円、分子生物学用試薬購入費として150000円、ディスポプラスチック器具購入費として150000円を計画している。
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