| 研究課題/領域番号 |
15K14691
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
福居 俊昭 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (80271542)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 微生物工学 / 超好熱菌 / アーキア / TCAサイクル / メタボローム解析 |
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| 研究実績の概要 |
超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisはデンプンやピルビン酸を代謝し、アセチル-CoAの酸化分解と共役したプロトン還元により水素を発生させるが、このアセチル-CoAは最終的に酢酸として排出される。T. kodakarensisはクエン酸シンターゼ・アコニターゼ・イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を有しておらず、TCAサイクルが機能していないとされているが、近縁のPyrococcus furiosusはこれらの耐熱性酵素をコードする3遺伝子クラスター（Pf-TCA）を有している。本研究では、T. kodakarensisにPf-TCAを導入し、TCAサイクルを駆動させることによる影響を評価する。
昨年度までに強力プロモーターの下流にPf-TCAを連結したシャトルベクターをT. kodakarensisに導入し、さらに酢酸排出抑制のためにアセチル-CoAシンテターゼACSIまたはACSIIIを欠失させた株を作製し、予備的に検討した。今年度、このPf-TCA導入およびACSIII欠失を行った株について水素発生培養での詳細なマスバランス解析を行い、コハク酸生成量の増加に加えてアンモニア消費量が増加していることを確認した。これはPf-TCAにコードされるイソクエン酸デヒドロゲナーゼによってNAD(P)Hが過剰となり、還元的アミノ化によりNAD(P)+に再生している可能性が考えられた。さらにメタボローム解析を行ったところ、菌体内のクエン酸の増加、ホスホエノールピルビン酸の減少が観察されたことから、TCAサイクルの駆動が示唆された。またアセチル-CoAを生成する糖代謝に変異が生じたことで増殖能が低下した変異株をランダム変異の手法により単離し、変位部位を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
クエン酸シンターゼ・アコニターゼ・イソクエン酸デヒドロゲナーゼの3遺伝子（Pf-TCA）導入とアセチル-CoAシンテターゼIII欠失を施したT. kodakarensisの株のマスバランス解析とメタボローム解析の結果は、これらの改変によりTCAサイクルが駆動したこととよく一致したが、当初の予想に反して増殖能や水素生産能に大きな変化は見られなかった。また細胞内のイソクエン酸は顕著に減少していたことから、pf-TCAにより導入した３酵素の中でアコニターゼの活性が相対的に低く、導入した外来酵素の活性の均衡が取れていないことが示唆された。一方、Pf-TCAの導入には自律複製プラスミドをベクターとして用い、水素発生培養中ではベクター維持のためにロバスタチンを添加したが、ロバスタチンはアセチル-CoAを前駆体とするメバロン酸経路を阻害することから、その添加はアセチル-CoAや酢酸の代謝に影響を与える可能性も新たな懸念事項である。これらの遺伝子発現の不均衡の解消やロバスタチン添加を必要としない遺伝子組換え法の適用など、改変株の改良と再作製が必要となり、当初の計画から遅れることとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
Pf-TCAをプラスミドベクターではなく相同性組換えによって導入すれば、培養中での導入遺伝子の維持にロバスタチン添加は必要なくなる。そこで、TCAサイクルの3遺伝子クラスターであるPf-TCAを相同性組み換えによってT. kodakarensis染色体に導入した株を作製し解析する。Pf-TCAは約6kbpと長いため、必要に応じて個別の導入を繰り返すことで目的株を作製する。またT. kodakarensisのメタボローム解析について、代謝物抽出条件や分析条件などの最適化を行い、より信頼度の高い分析を行う。また取得した糖代謝変異株とその変異遺伝子について、詳細を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は一般的な遺伝子工学によるT. kodakarensis組換え株の作製と、その組換え株の培養および代謝物解析を主に実施し、装置購入や高価な試薬・キットを多量に必要とする実験が少なかったため、消耗品の使用額が当初見込みより少なくなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度までの問題点を解決する遺伝子組換え株の作製のため、遺伝子工学用酵素・キットやオリゴDNA合成に使用する。
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