古代色素「貝紫」生合成酵素の高選択的臭素化反応メカニズムの解明と応用

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14709
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 片岡 邦重 金沢大学, 物質化学系, 教授 (40252712)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: ブロモペルオキシダーゼ / 臭素付加反応 / 貝紫色素

研究実績の概要

近年，海洋性天然物である含ハロゲンヘテロ環有機化合物が抗菌・抗がん活性を示すことが明らかになり，含ハロゲン有機化合物が注目されている。二臭化インディゴの分子構造をもつ貝紫は，色素前駆体である臭化インドール誘導体2分子が縮合して生成するが，この色素前駆体の位置特異的臭素化反応のメカニズムは未だ明らかではなく，この反応を触媒する酵素ブロモペルオキシダーゼは巻貝に微量しか含有しないため単離されてもいない。そこで本研究では，能登産のアカニシガイRapana venosaを研究材料に本酵素の精製を試みた。研究初年度には，ブロモペルオキシダーゼ活性測定系の開発と，アカニシガイにおける同酵素活性の検索を行った。アカニシガイの鰓下腺を摩砕し，その抽出液を調整したが，既報のモノクロロジメドンを基質とする活性測定では，抽出液に臭素化活性がほとんど検出されないことが明らかになった。そこで，市販の海藻由来のブロモペルオキシダーゼを用いて，基質及び活性測定系の検討を行った。貝紫色素前駆体の母核であるインドール，構造の近いトリプトファンを基質に用いてブロモペルオキシダーゼを作用させたところ，臭素化反応が進行し，基質のスペクトルが経時的に変化した。したがって，貝紫色素前駆体に近い構造の化合物を基質とする新規活性測定系の構築に成功した。また，ブロモペルオキシダーゼによるトリプトファンを基質とする臭素化反応はこれまでほとんど報告がないことから，今後，生成物を単離精製し，臭素化部位の特定などを行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

アカニシガイ10 kgから鰓下腺を取り出し，氷温下で海砂・アルミナを用いて乳鉢で摩砕した。遠心分離後，上清を回収し，これを粗酵素液とした。一般的な臭素化反応基質であるモノクロロジメドンを基質に用いて粗酵素液の臭素化活性を測定したところ，微弱な活性しか検出されなかった。そこで，1) 基質及び活性測定反応系の改善，2) 粗酵素液に含まれると考えられる反応阻害物質の除去，3) 鰓下腺以外の内臓組織を対象としたブロモペルオキシダーゼ活性の検索の３つの方針で活性検出方法の改善を図ることとした。現在までに，貝紫色素前駆体に近い構造を持つインドール系化合物を基質とする活性測定系の構築に成功しており，これを用いてアカニシガイ内臓を対象に臭素化活性の探索を行っている。

今後の研究の推進方策

これまでの研究から，鰓下腺から得られる目的のブロモペルオキシダーゼは非常に微量だと考えられる。これを効率的に精製するために，アフィニティークロマトグラフィー法の使用を試みる。アフィニティーリガンドには基質アナログであるインドール誘導体，またはトリプトファン誘導体を用い，CNBrやエポキシで活性化したスペーサーを持つ樹脂と反応させることでリガンドを固定化したオリジナル樹脂を作製する。これら自作アフィニティー樹脂によるクロマトグラフィーと，市販樹脂による各種クロマトグラフィー，または電気泳動法などを駆使して酵素精製条件の検討を行う。さらに，ブロモペルオキシダーゼによるトリプトファンの臭素化生成物をクロマトグラフィーで単離・精製し，各種機器分析法を用いて臭素化部位の検討を行う予定である。