| 研究課題/領域番号 |
15K14806
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
池上 晋 慶應義塾大学, 自然科学研究教育センター, 訪問教授 (80011980)
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| 研究分担者 |
金子 洋之 慶應義塾大学, 文学部(日吉), 教授 (20169577)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | タンパク質 / 分離法 / 分析 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らは棘皮動物イトマキヒトデの胚に、細胞核に局在する核型トランスグルタミナーゼ（Nuclear trans- glutaminase, nTGと略称）を見出した。nTGの翻訳を阻害するモルフォリノ・アンチセンスオリゴ(MO)を卵に注入し、受精させたところ、胚期の初期発生は正常に進行してビピンナリア幼生期に達し、遊泳・摂餌して形態上、正常な消化器官と神経系が発達した。しかし、その後、成長速度が低下し、幼生はブラキオラリア期に達したものの変態しなかった。
本研究は、ビピンアリア幼生の発生過程でnTG がどのように細胞内局在を変化させるかを生化学的、免疫組織化学的に追跡した。染色試料を共焦点レーザー顕微鏡下で撮影し、二重染色像を得た。その結果、MO 非注入６日幼生では大部分の細胞核においてnTG が細胞核特異色素での発色シグナルと重なっていたが、nTG MO を注入した６日幼生の細胞核では予想通り nTG の染色シグナルは認めらず、nTGの欠失が確認された。一方、MO非注入6日幼生では、繊毛帯細胞の多くで細胞質にnTGの染色シグナルが確認され、細胞核にはシグナルが認められなかった。
次に、正常6日幼生をホモジェナイズし、遠心分離して細胞核画分と細胞質画分に分離した。これらをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜に転写した。家兎抗nTG抗体を用いて膜の免疫染色を行ったところ、細胞質画分にnTGより分子サイズが少し大きいnTGシグナルが確認された。この結果から、中期ビピンナリア期ではnTGが分子修飾によって細胞核から細胞質に移行し、摂餌・栄養を支える機能分子として発生進行に寄与するが、nTG欠失ビピンナリア幼生ではこれを欠くために栄養不全が生じ、ブラキオラリア幼生への移行期で発生異常がもたらされることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、nTG MOを注入した幼生においては一次代謝異常が生じ、それによってブラキオラリア幼生への移行期で発生異常が生じると予想していたが、予備的な実験からその可能性が薄まり、むしろ、nTG関連タンパク質の生成によってもたらされる餌生物の消化・吸収過程阻害の可能性が浮上した。これを検証するために広範な共焦点レーザー顕微鏡観察実験を重ねる必要が生じた。このため、時間的な遅れは生じたものの、丁寧に行った免疫組織化学実験が実りある好結果がもたらしたものと確信している。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞質に移行するnTGの分子修飾の実態と修飾nTG 分子の機能を解明するための実験を遂行する。また、本タンパク質はin vitro で異なったポリペプチド間にepsilon-(gamma-glutamyl)lysine 架橋を生じ二量化する反応を触媒するが、本研究でビピンアリア幼生の細胞核中に存在するヒストンが二量化、あるいは多量化している可能性を検討する。また、細胞質タンパク質が二量化、あるいは多量化している可能性についても検討を加える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗にともなって、免疫組織化学的実験に注力する割合が多くを占め、これに要する消耗品は比較的潤沢に保蔵してあったので、新しく導入する試薬、器材の購入は少量にとどまった。逆に、平成28年度に使用を予定していたメタボローム実験関連の質量分析などを行わなかったのでこれに関連した消耗品費を使用することはなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度は nTGを欠損させたイトマキヒトデ幼生に13C 標識珪藻を給餌させ、幼生体内での13C標識一次代謝物がどのように代謝・同化されるかを、主として質量分析法によって解析する。これには、当初、研究経費として計画したメタボローム解析用の消耗品費を充当する。
これまでの研究過程で明らかになった発生進行に伴う nTGの化学変化を可及的に多くの質量分析実験で解析を進め、その実態を明らかにする。このために必要な試薬、器材の購入に消耗品費を充てたい。
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