|
今年度は昨年度のマイクロアレイ解析の結果を基に、ウシ血漿中に検出されるmiRNA分子種の定量的RT-PCR法による測定法の確立及び検証を実施した。
血漿中miRNAはmiRNeasy serum/plasmaキットを用いて抽出し、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis キットを用いてcDNAを合成した。定量的リアルタイムRT-PCRにはKOD SYBR qPCR Mixを使用し、各miRNAの塩基配列に対応するオリゴDNAを合成して標準曲線を作成した。miRNA発現の安定性はNormFinderソフトウェアを用いて評価した。また、溶血によるmiRNA発現定量への影響を評価するために、溶血試料を調製し、定量的RT-PCRを行った。昨年度のマイクロアレイ解析の結果から得られた妊娠牛血漿中で発現量が上昇していたmiRNA分子種について、合成オリゴDNAを用いて標準曲線を作成したところ、良好な直線性が得られ副産物も認められなかった。これらのmiRNA分子種について、妊娠牛および非妊娠牛間の比較を行ったところ、いくつかの分子種は妊娠牛血漿中で高い発現量を示した。さらに、マイクロアレイ解析で検出されたmiRNAについて、NormFinderを用いて発現安定性を解析し、安定性が高かったリファレンス遺伝子候補のmiRNAを選出、定量的RT-PCRによる検証を行った。この定量結果をNormFinderで解析したところ、最適なリファレンス遺伝子として3種類のmiRNA分子種を選出された。また、これらのmiRNA分子種の発現量は溶血による影響を受けなかったことから、妊娠牛と非妊娠牛における血漿中miRNAの定量解析時に使用できるリファレンス遺伝子miRNAを明らかにした。
|
