| 研究課題/領域番号 |
15K14852
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
米山 裕 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10220774)
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| 研究分担者 |
野地 智法 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10708001)
秦 英司 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, 上級研究員 (50355153)
林 智人 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, ユニット長 (90297630)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 黄色ブドウ球菌 / 乳房炎 / トランスポゾン / 形質転換 |
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| 研究実績の概要 |
近年、抗生物質耐性菌の出現とその広がりは公衆衛生上大きな脅威となっている。医療現場における過剰な抗生物質の使用が耐性菌出現の主な原因と考えられているが、動物生産現場での成長促進目的の飼料への抗生物質添加がこの耐性菌出現と関連していることが近年指摘され、その対策が求められている。酪農現場におけるウシ乳房炎は経済的損失が大きく、起因菌の中でも黄色ブドウ球は再発を繰り返し難治化する傾向があることから、その新規防除法の開発は喫緊の課題である。これまでヒト由来黄色ブドウ球菌の病原因子に関する研究は多くあるが、ウシ由来株を対象とした乳房炎関連病原因子の基礎微生物学的研究はほとんどない。そこで、本研究ではウシ由来黄色ブドウ球菌の病原因子を、トランスポゾン挿入変異ライブラリー法を用いて探索する研究を開始した。この手法はライブラリーを構築するために、２つのプラスミド（pBursa, pFA545）をウシ由来黄色ブドウ球菌への形質転換する必要がある。昨年度の研究では、当初使用していたウシ由来SA1006株の外来DNAに対する制限が非常に強いためプラスミドを形質転換することができなかった。そこで、宮城県の酪農現場から分離された黄色ブドウ球菌を対象とし、プラスミドの形質転換が可能な菌株をスクリーニングして見いだしたSA5株に個々のプラスミドの形質転換を試み成功した。これらの菌株SA5(pBursa)とSA5(pFA545)から各々のプラスミドを分離精製し、SA5(pFA545)およびSA5(pBursa)に形質転換を試みたその結果、複数の形質転換多が得られた。これらの細胞からプラスミドを分離し制限酵素解析を行った結果、オリジナルの各プラスミドと同じ切断断片が認められたことから、両プラスミドをもつSA5(pBursa, pFA545)株を得ることに成功したことが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
黄色ブドウ球菌の形質転換効率はモデル生物である大腸菌に比べその効率は遙かに低い。特に、外来DNAに対する制限能の強い自然界から分離した黄色ブドウ球菌野生株を対象とした形質転換効率は非常に低く、それを対象とした組換え実験は困難である。本研究では当初予定していた共同分担者から分与されたウシ由来のSA1006株への形質転換がまったくできなかったため、宮城県北部の酪農現場から宮城NOSAIによって分離された乳房炎由来の黄色ブドウ球菌株（約20株）を対象として、形質転換可能な野外株の選抜を進める必要があった。このような経緯から当初予定していたトランスポゾン挿入変異ライブラリーの構築に必要なプラスミド(pBursaとpFA545)を共に導入した形質転換体の取得が遅れていた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ウシ乳房炎由来の黄色ブドウ球菌にトランスポゾン挿入変異ライブラリーの構築に使用する２つのプラスミド(pBursaとpFA545)をエレクトロポレーション法で導入することに成功し、両プラスミドをもつ形質転換体SA5(pBursa, pFA545)を取得することに成功した。そこで、次にこの形質転換体を高温処理することによってトランスポゾンがSA5ゲノム上にランダムに挿入変異を起こしたライブラリーを構築する。このライブラリーはトランスポゾンがSA5ゲノム上にランダムに挿入変異を起こしていることが必要条件となる。そこで、このトランスポゾン挿入変異ライブラリーをウシ乳房に感染させる前に、ライブラリーの質、すなわちトランスポゾン挿入のランダムネスを検証するために挿入クローンのゲノムを抽出し、制限酵素AciI切断後ライゲーション反応を行った後、トランスポゾンの両端配列に相補的なプライマーを用いてインバースPCR反応を行い増幅断片の長さがランダムであることを確認する。その後、このライブラリーをウシ乳腺組織に感染させ実験的モデル乳房炎を成立させ、乳房炎が発症した乳房より黄色ブドウ球菌を回収する。回収された黄色ブドウ球菌のゲノム上に挿入されたトランスポゾンの位置を前述のインバースPCRの方法に従い同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していた酪農現場由来の黄色ブドウ球菌SA1006株へのプラスミドの形質転換について、当初の予想に反し牛から分離した黄色ブドウ球菌野外株は外来DNAに対する制限能が非常に強い事が判明した。この対策のため、トランスポゾン保有プラスミドをウシ由来株へ導入するため、宮城県酪農現場由来の乳房炎由来株の形質転換効率の高い株の選抜等各種条件検討を実施する必要が生じた。このため、トランスポゾン挿入変異ライブラリーを構築した後に使用する高価な制限酵素、PCR試薬、シーケンス試薬を購入することがなかったことが次年度使用額の生じた主な理由である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度の研究成果を踏まえ、トランスポゾン挿入変異ライブラリーの構築と、そのゲノム上へのトランスポゾンのランダムな挿入の検証を前述のインバースPCR法で行った後、ウシにこのライブラリーを感染させる実験を行う。そして、実験的乳房炎が成立した後、炎症反応を起こした乳房より黄色ブドウ球菌を回収し、トランスポゾンが挿入したゲノム上の位置をシーケンス反応を行って同定する。この一連の実験でゲノム抽出、インバースPCR、シーケンス反応等の実験を行うためのキット、試薬等を購入する予定である。また、本研究を遂行するために必要な情報収集あるいは成果発表のために学会参加、旅費などに経費を充当する予定である。
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