口蹄疫ウイルスRNAの特異的翻訳抑制と耐病性家畜開発に向けたアプローチ

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14871
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 小原 恭子 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (20225478)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: FMDV / IRES / PTB / 4E-BP1 / ITAF45 / CPK細胞 / MDBK細胞 / MDCK細胞

研究実績の概要

当該年度は、まず口蹄疫ウイルス(Foot-and mouth disease virus ; FMDV)ゲノムRNAの非翻訳領域(5’UTR)内の40Sリボゾームの内部認識領域(Internal Ribosomal Entry Site; IRES)からの翻訳活性を各種動物由来細胞で比較解析を行った。HEK293（ヒト）、MDCK(イヌ)、MDBK(ウシ)、CPK(豚)細胞株でIRES活性を比較した結果、翻訳活性の強さはMDBK, MDCK, HEK293, CPK細胞の順であった。従って、FMDVの感染感受性との相関は見られなかった。また、MDCK, MDBK, CPK細胞を用いてIRES活性に関与する宿主因子をsiRNAを用いて探索した結果、poly-pyrimidine-tract binding protein (PTB), eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1)とIRES trans-acting factor (ITAF45)がFMDV-IRES活性に関与している事が明らかとなった。このうち、ITAF45はMDCK, MDBK, CPKの全ての細胞でFMDV-IRES活性に関与していたが、PTBと4E-BP1はMDBK、CPK細胞でのみFMDV-IRES活性に関与していた。以上の結果から、宿主因子により各種動物由来細胞での作用が異なり、PTBや4E-BP1はFMDVの感染感受性細胞でのみIRES活性に作用する事が明らかとなった。従って、PTBと4E-BP1はFMDV感染感受性の決定に寄与する可能性が示唆された。以上の結果は、BMC Veterinary Researchに報告した（12:66, 2016）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

海椎茸(Renilla)ルシフェラーゼと蛍(Firefly)ルシフェラーゼ遺伝子を持つジシストロニックレポータープラスミドを用い、細胞mRNAが行うキャップ依存性翻訳はRenillaルシフェラーゼ活性(1st cistron)、FMDV-IRES活性はFireflyルシフェラーゼの活性(2nd cistron)で測定 した（ジシストロニックIRESベクター）。FireflyルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼの比(F/R)が小さくなるほど、よりFMDV-IRES特異的に翻訳が抑制されると考えられる。このアッセイ系を用いて解析をした結果、FMDVの感染域とIRES活性は相関しない事を明らかにした。しかしながら、siRNAを用いて翻訳に関与する宿主因子の作用を検討した結果、PTBや4E-BP1といった宿主因子がFMDVの感染感受性の決定に寄与する可能性も明らかとなった。これらの結果は、査読のある国際紙(BMC Veterinary Research)に投稿して受理されている。また、宿主因子作用の阻害剤（低分子化合物）の探索も開始した。以上の事から、研究はおおむね順調に進行している。

今後の研究の推進方策

１．今年度は、siRNAだけではなく、宿主因子の作用阻害剤も用いて、FMDV-IRES活性に関与する翻訳因子の活性を抑制する事を試みる。
２. FMDV-IRESを発現する細胞株を樹立し、阻害剤のスクリーニングに用いる。
３．FMDV抗病性動物作出への試みとして、FMDV-IRES活性に関与する宿主因子(4E-BP1等）を欠損するノックアウトマウスを用いたFMDV感染実験の共同研究の可能性を探索する。
４. ２で探索したFMDV-IRES活性の発現を抑制する阻害剤を用いて、共同研究によりFMDV感染への効果を評価可能か、検討を進める。
5. FMDV-IRES活性を動物体内で測定する方法を新たに確立する。具体的には、FMDV-IRESを発現するジシストロニックベクターのプラスミドDNAをハイドロダイナミック法でマウス肝臓内で発現する実験系を確立する。この系では、ルシフェラーゼ活性を測定する事によって動物体内でのFMDV-IRES活性の測定が可能となる。この実験系を用いて、4E-BP1, PTB等の宿主因子作用の阻害剤を投与し、IRES活性を生体内で特異的に阻害できる物質を探索する。生体内でのFMDV-IRES活性測定系が確立すれば、抗FMDV活性を持つ新たな薬剤をスクリーニングできる実験系として、応用研究への展開が期待される。

研究成果

• [雑誌論文] IRES-mediated translation of foot-and-mouth disease virus (FMDV) in cultured cells derived from FMDV-susceptible and -insusceptible animals. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kanda T, Ozawa M, Tsukiyama-Kohara K
  • 雑誌名: BMC Vet Res. 巻: 12 ページ: 66
  • DOI: 10.1186/s12917-016-0694-8.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Contribution of the interaction between the rabies virus P protein and I-kappa B kinase e; to the inhibition of type I IFN induction signalling. (2016)
  • 著者名/発表者名: Masatani T, Ozawa M, Yamada K, Ito N, Horie M, Matsuu A, Okuya K, Tsukiyama-Kohara K, Sugiyama M, Nishizono A.
  • 雑誌名: J Gen Virol. 巻: 97 ページ: 316-326
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000362. Epub 2015 Dec 8.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Isolation and characterization of influenza A viruses from environmental water at an overwintering site of migratory birds in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okuya K, Kawabata T, Nagano K, Tsukiyama-Kohara K, Kusumoto I, Takase K, Ozawa M.
  • 雑誌名: Arch Virol. 巻: 160 ページ: 3037-3052
  • DOI: 10.1007/s00705-015-2610-0.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Full genome sequences of torque teno sus virus strains that coinfected a pig with postweaning multisystemic wasting syndrome in Japan: implications for genetic diversity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ozawa M, Kawabata T, Okuya K, Nagano K, Kanda T, Kanazawa N, Tsukiyama-Kohara K, Taneno A, Deguchi E.
  • 雑誌名: Arch Virol. 巻: 160 ページ: 3067-3074
  • DOI: 10.1007/s00705-015-2593-x.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Efficacy of Recombinant Canine Distemper Virus Expressing Leishmania Antigen against Leishmania Challenge in Dogs. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miura R, Kooriyama T, Yoneda M, Takenaka A, Doki M, Goto Y, Sanjoba C, Endo Y, Fujiyuki T, Sugai A, Tsukiyama-Kohara K, Matsumoto Y, Sato H, Kai C.
  • 雑誌名: PLoS Negl Trop Dis. 巻: 9 ページ: e0003914
  • DOI: 10.1371/journal.pntd.0003914.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Genetic and serological surveillance for non-primate hepacivirus in horses in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Matsuu A, Hobo S, Ando K, Sanekata T, Sato F, Endo Y, Amaya T, Osaki T, Horie M, Masatani T, Ozawa M, Tsukiyama-Kohara K.
  • 雑誌名: Vet Microbiol. 巻: 179 ページ: 219-227
  • DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.05.028.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Efficient isolation of Swine influenza viruses by age-targeted specimen collection. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ozawa M, Matsuu A, Yonezawa K, Igarashi M, Okuya K, Kawabata T, Ito K, Tsukiyama-Kohara K, Taneno A, Deguchi E.
  • 雑誌名: J Clin Microbiol. 2015 Apr;53(4):1331-8. 巻: 53 ページ: 1331-1338
  • DOI: 10.1128/JCM.02941-14.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [備考] TADセンター
  • URL: http://www.vet.kagoshima-u.ac.jp/kadai/TAD/index.php