研究課題
昨年度までの研究では、口蹄疫ウイルス(Foot-and mouth disease virus ; FMDV)ゲノムRNAの非翻訳領域(5’UTR)内の40Sリボゾームの内部認識領域(Internal Ribosomal Entry Site; IRES)からの翻訳活性をHEK293(ヒト)、MDCK(イヌ)、MDBK(ウシ)、CPK(豚)細胞株でIRES活性を比較した結果、翻訳活性はMDBK, MDCK, HEK293, CPK細胞の順で強かったため、FMDVの感染域との相関はない事が明らかとなった。また、IRES活性に関与する宿主因子が、poly-pyrimidine-tract binding protein (PTB), eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1)とIRES trans-acting factor (ITAF45)である事が明らかとなった。これら宿主因子の翻訳における作用は各種細胞株で確認できた。そこで今年度は、FMDV-IRES活性を阻害する薬剤や低分子化合物のスクリーニングに役立つFMDV-IRES発現細胞の樹立を行った。由来する動物種によって細胞でのIRES活性が大きく異ならない事や、siRNAによるゲノムワイドなランダムノックダウンが容易にできるように既に全ゲノム配列が明らかとなっているヒト由来の細胞HEK293を用いて作製した。これらの細胞では、海椎茸(Renilla)ルシフェラーゼと蛍(Firefly)ルシフェラーゼ遺伝子の間にFMDV-IRES配列を持つジシストロニックレポータープラスミドを発現させ、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて発現細胞を樹立した。その結果、FireflyルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼを発現する40クローンの細胞株を樹立した。今後これらの細胞を用いてFireflyルシフェラーゼ活性のみを阻害し、Renillaルシフェラーゼ活性を阻害しない物質を探索する事によってFMDV-IRES特異的な阻害剤を得る予定である。また、ゲノムワイドなsiRNAやCrispr/Cas9によるランダムノックダウンにも有用なツールとなる事が期待される。
すべて 2017 2016 その他
すべて 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 5件、 査読あり 6件、 オープンアクセス 6件、 謝辞記載あり 6件) 備考 (1件) 産業財産権 (1件)
Infect. Genet. Evol.
巻: S1567-1348(17) ページ: 30116-8
10.1016/j.meegid.2017.04.003.
BMC Vet Res.
巻: 12 ページ: 66
10.1186/s12917-016-0694-8.
Exp Anim.
巻: 65 ページ: 285-92
10.1538/expanim.15-0123.
Virus Genes
巻: 52 ページ: 671-8
10.1007/s11262-016-1360-8.
Oxid Med Cell Longev.
巻: 2016 ページ: 7425628
10.1155/2016/7425628.
J Clin Transl Hepatol.
巻: 4 ページ: 228-233
10.14218/JCTH.2016.00021
http://www.vet.kagoshima-u.ac.jp/kadai/TAD/index/php