| 研究課題/領域番号 |
15K14877
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉本 実紀 京都大学, 農学研究科, 助教 (20243074)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 哺乳類 / 卵巣 / 卵胞 / 雌 / 生殖 / 生殖寿命 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、雌性生殖寿命の延長を目的として、卵巣内で長期維持される卵胞の形成を顆粒層前駆細胞の追加ならびに成長因子等により増強する方法を開発しようとしている。本年度は出生前後のマウス卵巣を使用して、卵巣表層細胞の分離および細胞表面マーカーを指標とした顆粒層前駆細胞の分離と同発生段階の卵巣への追加・器官培養、増強因子の検討（前年度から継続）を行った。卵巣表層細胞の分離について酵素処理条件を変更して検討したが、回収量と純度が共に高い条件が決定できなかった。細胞表面マーカーを指標とした細胞の分離については抗体標識ビーズを使用した方法を検討した。卵巣を酵素処理および機械的破砕により分散後、抗Lgr5抗体結合ビーズによる細胞の分離、回収と蛍光色素（CM-DiI）による標識を行った。回収された細胞を同じ手法により分散させた胎仔～新生仔マウス卵巣細胞と混合し、懸濁培養を行ったところ、部分的に凝集し細胞塊を形成した。これを蛍光顕微鏡で観察したところ、一部で蛍光が陽性の細胞が観察された。しかし、標識の強度が細胞回収直後に固定して観察した場合と比較して微弱であり、標識細胞の変性後の二次的取り込みである可能性もある。細胞生存率が低いことも問題であるので引き続き手法の改良を行い検討する。増強因子としてR-spondin-1の効果については培養条件の変更を含めて検討したところ、一部の実験において卵胞数に変化が見られたが、変動が大きく安定した結果ではなく、検討を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
新生仔期卵巣からの細胞分離法についてはある程度の条件検討ができたが、卵巣への追加を行った場合の効果が明らかにできていないため。また、増強因子に関しても安定した結果が得られておらず、有用なものが発見できていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に基づき培養による検討を行い、有効性が期待できる処理法については移植、投与等によるin vivoでの検討を行う。移植後の経過期間については、研究期間で可能な範囲で検討する。前年度までの実験で採取した標本の解析に基づく処理条件の再検討、改良と他の成長因子等による処理を検討するとともに、培養法についても培養環境等の手法面、卵胞形成に作用する添加物の追加等を含めて改良し、処理効果の判定を容易にすることで解析効率を上昇させる。また、処理群間での遺伝子発現の比較により卵胞形成の初期段階での変化の検出を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入物品等が予定より少なかった。また、キャンペーン等で予定より安価で購入できた試薬、器具等があったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
試薬、器具類、実験動物等の購入および共通機器使用料に使用する。動物実験において処置時および飼育中の管理向上が求められているため、関連の器具、装置を購入する可能性がある。
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