ゼブラフィッシュを用いた全個体レベルでの免疫系解析モデルの開発

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14879
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 一戸 辰夫 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (80314219)
• 研究分担者: 本庶 仁子 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 特任准教授 (80614106)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ゼブラフィッシュモデル / 免疫系 / 主要組織適合性抗原 / 造血細胞移植 / 次世代シーケンサー

研究実績の概要

本研究の目標は、ゼブラフィッシュの優れたモデル生物としての特性を利用し、主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex, MHC)相同遺伝子の組み替え型個体や免疫不全個体の作成によって安定した造血細胞移植のシステムを確立するとともに、それらを利用して個体全体に存在するT細胞/B細胞レパトワの網羅的かつ鳥瞰的な解析技術を開発することである。この目的を達成するため、平成27年度は、まず、ゼブラフィッシュの単一個体に存在する全てのT細胞およびB細胞のクローンを、得られた全個体由来のリンパ球RNAからアダプター配列を用いてcDNAを作成し、T細胞受容体・B細胞受容体のCDR3コード領域遺伝子配列の高速シーケンシングを行うことによって、網羅的かつ定量的に同定する技術の開発に着手するとともに、ゼブラフィッシュのMHC遺伝子のタイピング法を確立し、造血細胞移植モデル作成のために、申請者の研究室で保有しているさまざまな野生型および遺伝子改変型ゼブラフィッシュのMHCハプロタイプを同定した。また、造血細胞移植モデルの確立のために必要となる移植前処置法を確立するため、さまざまな発生段階におけるゼブラフィッシュ個体の放射線感受性に関する検討を行い、成果の一部を国際学会に公表した。これらの研究に加え、ゼブラフィッシュのMHC遺伝子の編集技術を開発するため、CRISPR/Cas9を用いたMHC遺伝子の切断と挿入を行うための予備実験を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

T細胞受容体・B細胞受容体のCDR3領域遺伝子配列の網羅的同定技術に関しては、連携研究者と共同でMiSeqシステムをプラットフォームとする解析系を確立し、すでにヒト検体での安定した解析が可能となっている。現在はゼブラフィッシュのTCR遺伝子の配列に基づいたアラインメントプログラムの開発を進めている。また、ゼブラフィッシュ個体のMHCハプロタイプ同定の過程で、ある野生型において、MHCクラスI遺伝子のうち、従来報告されているU遺伝子を保有せず、全く新しい相同遺伝子を保有している可能性が高いものを発見したため、現在そのクローニングのためにプライマー設計を行い、既に予想された長さの PCR 増幅産物が得られており、今後全長の塩基配列の決定に着手する予定である。造血細胞移植モデルの作成のため、c-myb機能喪失個体を入手し、同種間でのwhole kidney marrowの移植を行うための準備を進めている。

今後の研究の推進方策

研究の開始後、当初予想されていた以上に実験量が増大しており、特にTCR/BCRの網羅的同定技術の確立とMHC遺伝子改変を含めた移植モデルの確立に必要な実験を迅速に推進するために、本研究にかかわる研究室内の大学院生と技術補佐員の増員を予定している。また、TCR/BCRの遺伝子配列決定についても、研究室内での作業量が膨大となることから、効率的な研究の推進のため、連携研究者の研究室に委託することを計画している。

次年度使用額が生じた理由

平成27年度はゼブラフィッシュ個体のMHC同定に傾注し、造血幹細胞移植の実験を行わなかっため、移植用ゼブラフィッシュの飼育備品の購入費用などの物品費の支出を節減することが可能であったため。

次年度使用額の使用計画

平成28年度の研究に必要な生化学試薬・移植用ゼブラフィッシュ飼育備品の購入や、研究成果の論文投稿に要する費用等に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] 造血幹細胞移植におけるHLAの基礎知識. (2015)
  • 著者名/発表者名: 一戸辰夫.
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 56 ページ: 274-283
  • DOI: 10.11406/rinketsu.56.2134
  • 査読あり
• [学会発表] 同種造血幹細胞移植後のCD4+およびCD8+T細胞再構築過程の次世代シーケンサーを用いた網羅的解析. (2016)
  • 著者名/発表者名: 大島久美, 北浦一孝, 美山貴彦, 川瀬孝和, 井上暢子, 山田恭平, 粟屋忠佑, 石田誠子, 森岡健彦, 今川潤, 三原圭一朗, 中十奈苗, 鈴木隆二, 一戸辰夫.
  • 学会等名: 第38回日本造血細胞移植学会総会.
  • 発表場所: 名古屋市
  • 年月日: 2016-03-04
• [学会発表] Comprehensive T-cell receptor repertoire analysis using deep sequencing and single cell cloning reveals extreme oligoclonality of ex vivo expanded cytomegalovirus-reactive cytotoxic T-cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takahiko Miyama, Takakazu Kawase, Kazutaka Kitaura, Ren Chishaki, Masashi Shibata, Kumi Oshima, Hiroshi Hamana, Hiroyuki Kishi, Kiyotaka Kuzushima, Hiroh Saji, Ryuji Suzuki, Tatsuo Ichinohe.
  • 学会等名: 57th Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: Orlando, FL, U.S.A.
  • 年月日: 2015-12-05
  • 国際学会
• [学会発表] Comprehensive analysis of CMV-specific T-cell repertoire by deep sequencing and single cell cloning. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takahiko Miyama, Takakazu Kawase, Kazutaka Kitaura, Ren Chishaki, Masashi Shibata, Kumi Oshima, Hiroshi Hamana, Hiroyuki Kishi, Kiyotaka Kuzushima, Hiroh Saji, Ryuji Suzuki, Tatsuo Ichinohe.
  • 学会等名: 第77回日本血液学会学術集会.
  • 発表場所: 金沢市
  • 年月日: 2015-10-17
• [学会発表] Quantitative tracing of T-cell diversity using deep sequencing in a recipient of allogeneic HCT. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kumi Oshima, Kazutaka Kitaura, Takahiko Miyama, Takakazu Kawase, Tomoko Inoue, Seiko Ishida, Kyohei Yamada, Naoya Yamasaki, Tadasuke Awaya, Moe Okuno, Tetsumi Yoshida, Seiji Saito, Yoshiaki Kuroda, Sayaka Sugihara, Jun Imagawa, Shinya Katsutani, Keichiro Mihara, Teruhisa Fujii, Ryuji Suzuki, Tatsuo Ichinohe.
  • 学会等名: 第77回日本血液学会学術集会.
  • 発表場所: 金沢市
  • 年月日: 2015-10-16
• [学会発表] 次世代シーケンサーを用いた同種造血幹細胞移植後末梢血T細胞レパトワの網羅的解析. (2015)
  • 著者名/発表者名: 大島久美, 北浦一孝, 美山貴彦, 川瀬孝和, 中十奈苗, 鈴木隆二, 一戸辰夫.
  • 学会等名: 第24回日本組織適合性学会大会.
  • 発表場所: 水戸市
  • 年月日: 2015-09-10
• [学会発表] Analysis of radiation-induced responses during early embryonic development of zebrafish. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yasuko Honjo, Kenji Kamiya, Tatsuo Ichinohe.
  • 学会等名: 15th International Congress of Radiation Research
  • 発表場所: Kyoto, Japan
  • 年月日: 2015-05-27
  • 国際学会