| 研究課題/領域番号 |
15K14880
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
加納 聖 山口大学, 共同獣医学部, 准教授 (40312516)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 4倍体 / マウス / ES細胞 / 分化能 / ゲノム倍加 / 多倍体 / キメラ胚 |
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| 研究実績の概要 |
ゲノムセットを３個以上持つ多倍体は、魚類や両生類において正常な個体として発生が可能である一方、哺乳類において４倍体などの多倍体胚は胎生致死となる。申請者は最近、マウス４倍体胚盤胞から４倍体ＥＳ細胞の樹立に成功するとともに、マウスＥＳ細胞はゲノムが倍加しても胚性幹細胞としての基本的性質を持つことを明らかにした。当該年度では申請者らが樹立したマウス４倍体ＥＳ細胞をさらに詳細に解析することによって、哺乳類における多倍体胚の正常な発生条件の探索を行った。まずこれまでに樹立したマウス4倍体ＥＳ細胞は複数の胚盤胞期のマウス胚から樹立していたが、ゲノム倍加による性染色体への影響などをより詳細に解析するために、１個の胚盤胞期胚からマウス４倍体ＥＳ細胞の樹立を行い、雌雄由来それぞれの複数ラインの４倍体ＥＳ細胞を樹立した。マウス４倍体ＥＳ細胞の生体内での多分化能を解析するために、テラトーマの形成実験を行い、テラトーマを組織化学的に解析したところ、外胚葉・中胚葉・内胚葉の三胚葉への分化誘導が確認され、マウス４倍体ＥＳ細胞は分化能を有することを明らかにした。また、マウス４倍体ＥＳ細胞の試験管内での多分化能を解析するために胚葉体の形成を行い、三胚葉への分化誘導が起こることがわかった。Oct3/4とNanog遺伝子のプロモーター部位のメチル化解析をバイサルファイト法を用いてエピゲノム解析を行ったところ、４倍体ＥＳ細胞では２倍体ＥＳ細胞と同様にこの領域はほとんどメチル化されておらず、遺伝子発現抑制が起こっていないことがわかった。さらにEGFP陽性４倍体ＥＳ細胞と２倍体胚桑実胚の集合キメラ胚を作成したところ、胚盤胞期胚の内部細胞塊において４倍体ＥＳ細胞由来の細胞の分布が確認された。この結果によって４倍体ＥＳ細胞は将来胎子となりうる内部細胞塊の一部として機能しうる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は以下の項目について研究を行い、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。（1）新たなマウス４倍体ＥＳ細胞のライン樹立：これまでに樹立したマウス４倍体ＥＳ細胞は複数の胚盤胞期のマウス胚から樹立していたが、ゲノム倍加による性染色体への影響をより詳細に解析するために、１個の胚盤胞期胚からマウス４倍体ＥＳ細胞の樹立を行い、雌雄由来の４倍体ＥＳ細胞ラインを複数樹立した。（2）胚様体形成：マウス4倍体ＥＳ細胞の試験管内において多分化能を解析するために胚葉体の形成を行い、三胚葉への分化誘導が起こった。（3）テラトーマ形成：マウス４倍体ＥＳ細胞の生体内での多分化能を解析するために、テラトーマの形成実験を行い、形成されたテラトーマを組織化学的に解析したところ、外胚葉・中胚葉・内胚葉の三胚葉への分化誘導が確認され、マウス４倍体ＥＳ細胞は分化能を有することがわかった。（4）４倍体ＥＳ細胞キメラ胚の作成：EGFP陽性４倍体ＥＳ細胞と２倍体胚桑実胚を隣合わせて培養し集合キメラ胚を作成したところ、胚盤胞期胚の内部細胞塊において４倍体ＥＳ細胞由来の細胞の分布が確認された。この結果によって４倍体ＥＳ細胞は将来胎子となりうる内部細胞塊の一部として機能しうる可能性が示唆された。（5）マウス４倍体ＥＳ細胞における特異的発現遺伝子のエピゲノム解析：Oct3/4とNanog遺伝子のプロモーター部位のメチル化解析をバイサルファイト法を用いて行ったところ、２倍体ＥＳ細胞と同様にほとんどメチル化されておらず、これらの遺伝子発現が起こっていることがわかった。（6）網羅的遺伝子発現解析：RNAシークエンス法によって4倍体ＥＳ細胞と２倍体ＥＳ細胞の網羅的な遺伝子発現量の解析を行った。４倍体ＥＳ細胞と２倍体ＥＳ細胞間の詳細な比較データは現在解析中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1）キメラマウスの作成によるマウス倍体ＥＳ細胞の分化能の解析：平成２７年度に作出した、EGFP陽性４倍体ＥＳ細胞と２倍体胚桑実胚キメラ胚を胚盤胞期胚まで培養し、偽妊娠ICRマウス子宮に移植する。移植したキメラ胚については、４倍体細胞の各部位における寄与率や分布を組織化学的に観察し、4倍体細胞の胚体における発生能や定着能を調べる。（2）エピブラスト幹細胞（EpiSC）の誘導：マウス４倍体ＥＳ細胞から、胎子を構成する細胞により近い性質を持つマウス４倍体EpiSC（TEpiSC）の樹立を試み、ゲノム倍加によってEpiSCの樹立しやすさ、あるいは樹立したEpiSCの性質を解析する。またこのTEpiSCを用いて後述のX染色体不活性化などを解析する。（3）１細胞当たりの遺伝子発現量の解析：リアルタイムPCR法を用いて４倍体ＥＳ細胞１個あたりの絶対的な遺伝子発現量を解析する。同時に細胞のサイズを測定することによって、ゲノム倍加によって細胞内の遺伝子転写産物の濃度がどのような影響を受けるかについて調べる。（4）細胞周期の解析：４倍体ＥＳ細胞は２倍体ＥＳ細胞と比較して細胞増殖が遅い傾向があることがわれわれの研究によって明らかとなっている。それぞれの細胞周期（G0/G1期、S期、G2/M期）を測定し、ゲノム倍加によって細胞周期が受ける影響について調べる。（5）X染色体の不活性化：４倍体ＥＳ細胞、さらに分化させたTEpiSCにおいて、通常よりも本数の多いX染色体がどのように不活性化されているかについて解析する。（6）細胞周期を中心とした4倍体細胞の正常化：以上の結果をもとに、マウス４倍体胚の発生に影響を与えることが予想される因子を４倍体ＥＳ細胞に導入し、上記と同様の方法でキメラ胚ならびにキメラマウスを作出し、哺乳類における多倍体胚の正常な発生条件を探索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ計画通りに予算を使用したが（残額約25000円）、研究最終年度の平成28年度の研究遂行のために調整した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験遂行に必要な消耗品の購入に充てる予定である。
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