イヌiPS細胞から共培養細胞表面灌流による血小板の効率的作製

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14888
• 研究機関: 大阪府立大学
• 研究代表者: 稲葉 俊夫 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00137241)
• 研究分担者: 杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (30171143) ; 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 再生医療 / 統合動物科学 / iPS細胞 / 血小板 / バイオテクノロジー / トランスレーショナルリサーチ

研究実績の概要

本研究は、ヒトと共通の生活習慣病や老齢化による疾病が自然発症するイヌに着眼し、　イヌのiPS細胞を作製し、本細胞を用いた再生獣医学研究を推進するもので、イヌiPS細胞を用いて、造血系分化誘導サイトカイン遺伝子を導入したフィーダー細胞上で培養した後、生体内での血小板生成過程を模した体外培養システムで、効率的に血小板へ分化誘導することを目的としている。本研究年度では、イヌ造血サイトカインを発現するフィーダー細胞の作製、および前年度に作製した薬剤誘導性ベクターによるイヌiPS細胞は血小板に分化誘導することができなかったために、低分子阻害剤を用いて多分化能を有するイヌ多能性幹細胞の作製について検討し、以下の結果を得た。
１．前年度に作製したイヌ造血サイトカイン遺伝子導入OP9細胞株を培養し、本OP9細胞株からの造血サイトカインの発現を調べた結果、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)のタンパク質発現が確認された。
２．核初期化４因子を導入したイヌ体細胞を、トランスフォーミング増殖因子(TGF)β1阻害剤、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤などの低分子化合物の存在下で培養することにより、長期継代可能で胚体外内胚葉(XEN)マーカーを発現する人工胚体外内胚葉細胞様細胞（iXEN様細胞）の作製に成功した。本細胞は多分化能を有し、肝細胞特異的なマーカーであるアルブミンとCYP3A4遺伝子を発現する肝細胞、毛細胆管膜マーカーであるMRP2タンパクを発現する胆管上皮細胞、さらに、白血球系細胞へ分化させることができた。
今回の結果から、iXEN様細胞株とイヌ造血サイトカイン発現フィーダー細胞との共培養による血小板の大量培養に繋げていきたい。

研究成果

• [雑誌論文] Feeder-independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum-free conditions (2017)
  • 著者名/発表者名: Nishimura T, Hatoya S, Kanegi R, Wijesekera DPH, Sanno K, Tanaka E, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • 雑誌名: Molecular Reproduction and Development 巻: 84 ページ: 329-339
  • DOI: 10.1002/mrd.22789
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Generation of canine induced extraembryonic endoderm-like cell line that forms both extraembryonic and embryonic endoderm derivatives (2017)
  • 著者名/発表者名: Nishimura T, Unezaki N, Kanegi R, Wijesekera DPH, Hatoya S, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • 雑誌名: Stem Cells and Development 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1089/scd.2017.0026
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Production of feline leukemia inhibitory factor (LIF) with biological activity in Escherichia coli (2016)
  • 著者名/発表者名: 1.Kanegi R, Hatoya S, Tsujimoto Y, Takenaka S, T. Nishimura T, Wijewardana V, Sugiura K, Takahashi M, Kawate N, Tamada H, Inaba T.
  • 雑誌名: Theriogenology 巻: 86 ページ: 604-611
  • DOI: 10.1016/j.theriogenology.2016.02.013
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Methylprednisolone sodium succinate reduces spinal cord swelling, but has no effect of recovery in dogs with surgically treated intervertebral disc herniation (2016)
  • 著者名/発表者名: Nishida H, Tanaka H, Kitamura M, Inaba T, Nakayama M.
  • 雑誌名: Japanease Journal of Veterinary Research 巻: 64 ページ: 191-196
  • DOI: 10.14943/jjvr.64.3.191
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Exosomes derived from tumor cells genetically modified to express Mycobacterium tuberculosis antigen: a novel vaccine for cancer therapy (2016)
  • 著者名/発表者名: Koyama Y, Ito T, Hasegawa A, Eriguchi M, Inaba T, Ushigusa T, Sugiura K.
  • 雑誌名: Biotechnology Letters 巻: 38 ページ: 1857-1866
  • DOI: 10.1007/s10529-016-2185-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] "Artificial neoepitope"-bearing exosomes as novel vaccine for cancer immunotherapy (2016)
  • 著者名/発表者名: Koyama Y, Ito T, Inaba T, Sugiura K
  • 学会等名: 第45回日本免疫学会学術集会
  • 発表場所: 沖縄コンベンションセンター（沖縄県宜野湾市）
  • 年月日: 2016-12-05 – 2016-12-07
• [学会発表] 結核菌抗原遺伝子を用いた腫瘍治療メカニズムの解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷川綾、牛草貴博、小山義之、伊藤智子、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] ネコiPS細胞株のセンダイウイルスベクターを用いた作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 沖田良太、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、大高真奈美、西村健、中西真人、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] ウシ卵子の体外成熟培養時におけるMAPKK阻害剤 (U0126) 添加の胚発生に及ぼす影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 篠原健志、太田祥弘、川手憲俊、高橋正弘、坂上信忠、稲葉俊夫、玉田尋通
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] イヌ体細胞を用いた人工誘導胚体外内胚葉細胞の作製と肝細胞への分化誘導 (2016)
  • 著者名/発表者名: 畦﨑直哉、西村俊哉、金城綾二、Daluthgamage Patsy Himali Wijesekera、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、川手憲俊、玉田尋通、今井裕、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第159回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 日本大学生物資源科学部（神奈川県藤沢市）
  • 年月日: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [学会発表] 「人工ネオエピトープ」を担持した腫瘍由来エクソソームによるガン免疫治療 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小山義之、伊藤智子、長谷川綾、杉浦喜久弥、稲葉俊夫、江里口正純
  • 学会等名: 第3回日本細胞外小胞学会
  • 発表場所: グランドプリンスホテル広島（広島県広島市）
  • 年月日: 2016-08-31 – 2016-09-02
• [学会発表] Manipulation of tumor microenvironment by cytokine gene transfection enhances dendritic cell-based immunotherapy (2016)
  • 著者名/発表者名: Wijesekera D.P.H., Sugiura K, Ichida C, Yuba E, Kono K, Yamate J, Kanegi R, Nishimura T, Nadeeka H.D., Hatoya S, Inaba T.
  • 学会等名: ICI 2016-International Congress of Immunology 2016
  • 発表場所: Melbourne Convention and Exhibition Centre （Melbourne, Australia）
  • 年月日: 2016-08-21 – 2016-08-26
  • 国際学会
• [学会発表] Generation of multipotent canine extraembryonic endoderm-like cells via the formation of induced pluripotent stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Unezaki N, Nishimura T, Kanegi R, Wijesekera DPH, Hatoya S, Sugiura K, Kawate N, Tamada H, Imai H, Inaba T.
  • 学会等名: The International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 14th Annual Meeting
  • 発表場所: Moscone West（San Francisco, USA）
  • 年月日: 2016-06-22 – 2016-06-25
  • 国際学会
• [学会発表] "Artificial neoepitope"- bearing exosomes derived from tumor cells being genetically modified to express Mycobacterium tuberculosis antigen: a novel vaccine for cancer therapy (2016)
  • 著者名/発表者名: Koyama Y, Ito T, Eriguchi M, Hasegawa A, Inaba T, Sugiura K.
  • 学会等名: The 5th Annual Meeting of the International Society for Extracellular Vesicles
  • 発表場所: De Doelen Concert and Congress Center （Rotterdam, Netherlands）
  • 年月日: 2016-05-04 – 2016-05-07
  • 国際学会
• [備考] Laboratory of Cell Pathobiology
  • URL: http://www.vet.osakafu-u.ac.jp/english/cell/
• [産業財産権] イヌ人工誘導胚体外内胚葉細胞様株の作製方法 (2016)
  • 発明者名: 稲葉俊夫、西村俊哉、畦﨑直哉、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥
  • 権利者名: 大阪府立大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-116612
  • 出願年月日: 2016-06-10