| 研究課題/領域番号 |
15K14900
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
徳田 岳 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (90322750)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | シロアリ / 共生 / セルラーゼ / モノクローナル抗体 |
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| 研究実績の概要 |
近年、メタゲノムなどの包括的遺伝子解析により、シロアリ類の消化共生系からは多くの木質分解酵素およびその関連遺伝子の存在が報告されている。しかし、シロアリ腸内には1000 種類を超える多様な共生細菌が分布しており、木質消化には本質的に関与しない細菌叢まで含んだ単純なメタゲノム解析は断片的な情報を与えてきたにすぎない。そこで本研究では木質分解に中心的な役割を果たす細菌叢を分離精製し、その表層タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製を試みる。最終的には、得られた抗体によるイムノブロットの情報とメタゲノム情報を組み合わせ、木質分解に中心的に関与する酵素および関連遺伝子を明らかにすることを目的としている。
本年度は西表島に分布するタカサゴシロアリの後腸より解剖によって腸内容物を解剖し、これらをPercoll密度勾配遠心にかけることによって木片付着バクテリアを精製した。得られた木片付着バクテリアを抗原として、連携研究者である山口大学理学部の藤島教授の指導の下、バクテリア細胞表層を認識するモノクローナル抗体の作製を実施した。まず、精製した抗原をマウス3個体に免疫した。隔週3回の免疫ののち、マウスより脾臓を摘出し、ミエローマ細胞との細胞融合を行った。これを96穴プレートに播き、HAT培地を用いてハイブリドーマを培養した。この培養上清を用いて間接蛍光抗体法により、木片付着バクテリアを認識する１次抗体のスクリーニングを行った。その後、目的抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈し、さらに細胞培養を行った。シングルコロニーの培養上清に目的の抗体が確認できるまでスクリーニングを行った結果、バクテリア細胞表層を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを１２種類得ることができた。これらを大量培養した後、上清と細胞を液体窒素で凍結し、今後の実験用に極低温フリーザーに保管した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の計画では本年度から次年度にかけてモノクローナル抗体の取得を計画していたが、すでに数多くのモノクローナル抗体を得ることができた。そのため、３年目に計画していたモノクローナル抗体が認識するタンパク質の解析作業を、前倒しで２年目から一部実施できる予定であるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は得られた抗体を用い、クルードな腸内細菌叢と精製後の木片付着細菌叢との間で、交差反応性の違いを間接蛍光抗体法とウエスタンブロットによって解析する。また、モノクローナル抗体が反応するタンパク質を回収し、内部配列の同定を試みる。すでに木片付着バクテリアについてはメタゲノムやメタトランスクリプトームデータを取得しているので、それらと照らし合わせることで取得配列の重要性を考察する。また、万一、セルラーゼや関連タンパク質との反応が認められないなど、何らかの予期せぬ結果が得られた場合は、さらに精製法を検討しモノクローナル抗体の作製を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、本研究において得られた抗体について、他個体由来サンプルに対する交差反応性を確認するために、新たにサンプリング直後のシロアリ個体から得られた腸内容物を用いる予定であったが、日程的にサンプリングスケジュールの都合がつかず、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実際には採集直後のサンプルについても抗原の有無を判定する必要があるため、次年度のなるべく早い時期にサンプリングを実施して交差反応性を確認する予定である。
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