| 研究課題/領域番号 |
15K14911
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
阿部 敬悦 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50312624)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 輸送体 / 物質生産 |
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| 研究実績の概要 |
1. AAEx輸送体の基質輸送制御の解析
＜TrkA_Cドメインの結晶構造解析＞：リガンドが結合しAAExの基質輸送を制御していると推定されるTrkA_Cドメインについて、大腸菌を用いて発現・精製を行い、結晶の作製を進めている。これまでに、384 (96x4)種類の結晶化条件での結晶化を試みたが、現在のところ結晶は得られていない。 ＜AAEx輸送体の基質結合による構造変化の解析＞：蛍光修飾試薬を用いたラベリング実験により、AspTが基質であるAsp, Alaとの結合によりAsp結合コンフォメーション、Ala結合コンフォメーションを取ることを明らかにした。このことから、AspTはAsp輸送経路、Ala輸送経路を持ち、Asp, Ala交換輸送を成し遂げていることが推察された。
2. AAEx輸送体の結晶化と立体構造解析
＜AAEx輸送体の熱安定化条件の検討＞：精製AspTに熱を加えた後、ゲル濾過クロマトグラフィーに供し、AspTの持つトリプトファン蛍光を検出する、蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー（FSEC）により、AspTの熱安定化条件を検討した。その結果、AspTは高親和性基質であるAsp存在下で、AspTは安定化されることが明らかにした。 ＜AAEX輸送体の高純度精製方法の確立＞：AspTの高純度精製系の確立に向け、AspTのN末端にHis-tagとTEVプロテアーゼ切断配列を付加したコンストラクトを構築した。現在、このコンストストラクトを用いて、一度、アフィニティー精製したAspTをTEV処理後に、再度、Coカラムに供し、夾雑タンパク質を除去する方法により、高純度精製方法の確立を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. AAEx輸送体の基質輸送制御の解析
TrkA_Cドメインの結晶構造解析：これまでに大腸菌用の高発現ベクターpColdを用いることにより、TrkA_Cドメインの高発現系の構築を行った。結晶化に十分な量の精製タンパク質の獲得に成功した。これまでのところ結晶は得られていないが引き続き、結晶化スクリーニングを進める。
AAEx輸送体の基質結合による構造変化の解析：AspTが基質であるAsp結合コンフォメーションとAla結合コンフォメーションをそれぞれ持つことを明らかにした。これは、AspTについて複数の基質結合コンフォメーションがあることは、これまでに明らかにされておらず新たな知見であった。引き続き、人工膜小胞を用いた輸送解析により、AspTの輸送キネティクスの解析を進め基質輸送メカニズムの解析を進める。
2. AAEx輸送体の結晶化と立体構造解析
AAEx輸送体の熱安定化条件の検討：AspTの熱安定性の解析に向けて、CPMアッセイおよびSEC解析を進めた。CPMアッセイはAspTの熱安定性の解析には適しておらず、安定したデータを得ることができなかった。SEC法については、これまで検出系にUV吸収を使用していたが、トリプトファン蛍光を検出する手法に改良し、１０分の１量のタンパク質で解析することが可能となり、熱安定化条件の探索を進めることができた。
AAEX輸送体の高純度精製方法の確立： これまでに、AspTの発現系に適していることが明らかになってるpTrc99Aを基本ベクターとし、AspTのN末端にHis-tag, TEVプロテアーゼ認識配列を導入したコンストラクトを構築した。引き続き精製方法の検討を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. AAEx輸送体の基質輸送制御の解析
TrkA_Cドメインの結晶構造解析： 今年度実績の概要で述べた通り、現在、結晶化条件の探索を進めているが、これまでのところ結晶は得られていない。原因として、精製タンパク質の純度やTrkA_Cドメインの安定性が考えられる。今後は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、精製純度を上げるとともに、TrkA_Cドメインが安定化する条件をFSEC法により解析し、TrkA_Cドメインの結晶化を目指す。
AAEx輸送体のリガンド結合による基質輸送制御の解析：TrkA_Cドメインには、c-di-AMPを始め、何らかのリガンドが結合して、AspTの輸送制御をしていると推定されている。そこで、ITCもしくはFSEC法を用いて構造の安定化に導く因子を探索することで、TrkA_Cドメインに結合するリガンドの特定を目指す。
2. AAEx輸送体の結晶化と立体構造解析
AAEX輸送体の高純度精製方法の確立：本年度作成したTEVプロテアーゼ認識配列を導入したコンストラクトを用いて、高純度精製系の構築を進める。
AAEX輸送体の結晶化：TrkA_Cドメインの結晶化に用いている蒸気拡散法もしくはLCP法を用いて、AAExトランスポーターの結晶化を目指す。
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