創薬ターゲットの構造解析実現を目指したXFEL光による新規構造決定法の開発

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K14941
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中津 亨 京都大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (50293949)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: X線自由電子レーザー / X線結晶構造解析 / タンパク質 / 重原子同型置換 / 異常分散効果

研究実績の概要

創薬ターゲットを始めとする様々な膜タンパク質の中には10μm程度の微結晶ではあるものの、結晶ができているケースが知られている。しかしながら、X線回折強度が非常に小さい、もしくは取り扱いが難しいことから、立体構造決定に至らないことがしばしばである。そこで、従来の放射光施設に比べて、さらに約10億倍もの強度があるとされるＸ線自由電子レーザー（XFEL）を利用し、だれでも簡便に微結晶を使って新規タンパク質の立体構造を行なうための技術を開発することが本研究の目的である。
すでに、日本のXFEL施設であるSACLAにおいて、タンパク質結晶を安定な母液中にいれ、その溶液を流しておき、そこへＸ線を照射することで、1個の結晶から１つのデータをとり、たくさんのデータを連続的に得ることにより、立体構造が決定されてきている。しかしながら、この方法で得られる立体構造は、すでに構造が明らかになっているもののみで、全く構造がわからないものについてはSACLAを用いた構造決定法はでき上がっていない。
そこで、ルシフェリン再生酵素を用い、10μm程度の大きさが揃った微結晶を大量に作成した。新規構造決定法である重原子同型置換法を用いるために0.5mMの酸化水銀が入った溶液に結晶を浸すことにより、水銀を結合させた。水銀が結合していないNative結晶と、水銀が結合した結晶に対しSACLAからの12.6keVのX線を照射し、それぞれ約10000枚、約80000枚のイメージデータを測定した。
このデータを用いて異常分散効果を考慮した重原子同型置換(SIRAS)法による立体構造決定に成功した。また、Native,水銀結晶をそれぞれ10000枚のデータを用いることで構造決定に成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Redox-coupled proton transfer mechanism in nitrite reductase revealed by femtosecond crystallography. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fukuda Y., Tse KM., Nakane T., Nakatsu T., Suzuki M., Sugahara M., Inoue S., Masuda T., Yumoto F., Matsugaki N., Nango E., Tono K., Joti Y., Kameshima T., Song C., Hatsui T., Yabashi M., Nureki O., Murphy ME., Inoue T., Iwata S., Mizohata E.
  • 雑誌名: Pro. Nat. Acad. Sci. USA 巻: 113 ページ: 2928-2933
  • DOI: 10.1073/pnas.1517770113
  • 査読あり
• [雑誌論文] An isomorphous replacement method for efficient de novo phasing for serial femtosecond crystallography (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, K., Pan, D., Okuda, T., Sugahara, M., Kodan, A., Yamaguchi, T., Murai, T., Gomi, K., Kajiyama, N., Mizohata, E., Suzuki, M., Nango, E., Tono, K., Joti, Y., Kameshima, T., Park, J., Song, C., Hatsui, T., Yabashi, M., Iwata, S., Kato, H., Ago, H., Yamamoto, M., Nakatsu, T.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 14017
  • DOI: 10.1038/srep14017
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakane T, Song C, Suzuki M, Nango E, Kobayashi J, Masuda T, Inoue S, Mizohata E, Nakatsu T, Tanaka T, Tanaka R, Shimamura T, Tono K, Joti Y, Kameshima T, Hatsui T, Yabashi M, Nureki O, Iwata S, Sugahara M.
  • 雑誌名: Acta Cryst., D 巻: 71 ページ: 2519-2525
  • DOI: 10.1107/S139900471501857X
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] SACLA におけるシリアルフェムト秒タンパク質結晶構造解析の現状 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中津亨
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場
  • 年月日: 2016-06-08 – 2016-06-08
  • 招待講演
• [学会発表] X線自由電子レーザーを用いた新規タンパク質の立体構造決定 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山下 恵太郎, 潘 東青, 奥田 智彦, 菅原 道泰, 小段篤史, 山口 知宏, 村井 智洋, 溝端 栄一, 鈴木 守, 南後 恵理子, 登野 健介, 城地 保昌, 亀島 敬, 初井 宇記, 矢橋 牧名, 岩田 想, 加藤 博章, 吾郷 日出夫, 山本 雅貴, 中津 亨
  • 学会等名: 日本薬学会136年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2016-03-27 – 2016-03-27
• [学会発表] シリアル結晶学における重原子誘導体を用いた位相決定 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山下恵太郎, 潘 東青, 長谷川和也, 菅原道泰, 村井智洋, 小段篤史, 溝端栄一, 鈴木 守, 桝田哲哉, 平田邦生, 加藤博章, 吾郷日出夫, 熊坂 崇, 山本雅貴, 中津 亨
  • 学会等名: 平成27年度日本結晶学会年会
  • 発表場所: 大阪府立大学
  • 年月日: 2015-10-17 – 2015-10-17
• [学会発表] De novo structure determination for serial femtosecond crystallography using heavy atom derivatives 重原子誘導体を利用したシリアルフェムト秒結晶学による新規構造決定 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山下 恵太郎, 潘 東青, 菅原 道泰, 吾郷 日出夫, 山本 雅貴, 中津亨
  • 学会等名: 第53回生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学
  • 年月日: 2015-09-13 – 2015-09-13
• [図書] 光と生命の事典 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中津亨
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 朝倉書店