|
本研究では、生細胞でのRNAの発現誘導をリアルタイム検出できる細胞センサーの開発を行目指した。具体的には、検出対象となるRNAの塩基配列を特異的に認識できるようにデザインしたRNA結合タンパク質と再構成型蛍光タンパク質（N末とC末の2つに分断された蛍光タンパク質が空間的に隣接することで蛍光発光活性を再構成できる蛍光タンパク質）を連結したキメラタンパク質を構築して、細胞を生かした状態で検出対象のRNA発現を自在に検出するシステムを検討した。本手法は、転写プロモーターのレポーターアッセイ法などの従来法とは異なり、RNAの塩基配列情報のみで生細胞での遺伝子発現誘導を検出できるため、従来法に比べて本法は極めて便利なシステムとなる。また、従来のアッセイではタンパク質の発現を指標として遺伝子発現を検出しているのに対し、本手法ではRNA発現を検出するため、従来とは異なる原理で遺伝子発現を検出することが可能になる。
まず、病原体感染や熱ショックで誘導される遺伝子を検索し、検出対象とする遺伝子（特に、タンパク質へ翻訳されないノンコーディングRNAを標的とした）を複数確定した。次に、このノンコーディングRNAに特異的に結合するRNA結合タンパク質をデザインした。使用するRNA結合タンパク質としては、Pumilioタンパク質、IGF2BP3/IMP3タンパク質、UPF1タンパク質を検討したが、この検討の過程で、UPF1タンパク質による基質選択の新しいモデルを提案できた。
|
