| 研究課題/領域番号 |
15K15055
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
輿水 崇鏡 自治医科大学, 医学部, 准教授 (20392491)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 受容体 / ペプチドリガンド / 質量分析 / 蛍光タンパク質 / ルシフェラーゼ / 薬理学的リネージ解析 / 光振動エネルギー移動 |
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| 研究実績の概要 |
オーファン受容体は、未だ生体内の活性物質が不明な受容体群である。これらの受容体機能を変化させる化合物は、新たな治療に繋がる大きな可能性がある。本研究では、最も困難を伴うステップである、「新規の薬物標的」をオーファン受容体の中から同定する。すなわち、オーファン受容体の天然リガンドと医薬品のリード化合物を、新たな手法で見出す。これまで、リガンドと受容体は、鍵と鍵穴の如く厳密な対応関係にあると考えられてきた。しかし申請者らは、広い親和性を持つ合成ペプチドの同定に成功した。本研究では、この合成ペプチドの広い結合能を、未知のオーファン受容体に対する新規のリガンド探索に利用する。特に、高感度ハイスループット検出系と、質量分析装置を独自に融合させることを特徴とする。特に受容体を発光タンパク質と融合させて、蛍光標識ペプチドとの相互作用を指標に、化合物ライブラリからリガンドを絞り込む。まず検索対象とするオーファン受容体に対し、リガンドを探索する高感度アッセイ系を確立する。
１）解析対象オーファン受容体の抽出；アミノ酸配列解析からペプチドに親和性を有する可能性の高いオーファン受容体を、in silicoの検索より抽出する。この際、独自に開発した"Pharmacological lineage analysis"（薬理学的リネージ解析）を用いる。
２）発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現；細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する必要がある。発光タンパク付加により、受容体の結合能が障害されないことが必要である。
３）光振動エネルギー移動の検出系構築；発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動（BRET）を、高感度で検出する測定系を確立する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、受容体を発光タンパク質と融合させて、蛍光標識ペプチドとの相互作用を指標に、リード化合物や組織抽出液中からリガンドを絞り込む。現時点までで、検索対象とするオーファン受容体を絞り込み、リガンドを探索する高感度アッセイ系の確立に取り組んでいる。
１）解析対象オーファン受容体の抽出；in silicoの検索よりペプチドを離岸とする可能性の高いオーファン受容体を抽出した。この際、独自の"Pharmacological lineage analysis"（薬理学的リネージ解析）を用いた。実際にこの解析により、リガンドが既知であるヒト222受容体中より、GnRH受容体が特異的なペプチドに親和性を有することを予測し、実験的に確認した。
２）発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現；蛍光あるいは発光タンパク質と受容体を融合させて細胞に強制発現し、機能の解析を行った。細胞膜受容体のサブユニット相互作用を解析する際は、受容体カルボキシル基末端にGFPあるいはルシフェラーゼを付加したが、今回は異なり、新たに受容体アミノ基末端に付加する必要がある。発光タンパク付加により、受容体の結合能は障害されないことをV1bバゾプレッシン受容体-ルシフェラーゼ融合タンパクで確認している。
３）光振動エネルギー移動の検出系構築；発光タンパク受容体と蛍光ペプチドが結合した際だけに起こる光振動エネルギー移動を、高感度で検出する測定系を確立する。ATPに対する細胞膜P2X受容体のサブユニット相互作用についてBRETを用いて解析した系を応用することとした。さらに発光タンパク質の付加部位、発光基質の種類、発現量の検討などを行って測定系の高感度化を目指している。
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| 今後の研究の推進方策 |
オーファン受容体に結合する天然リガンドや化合物について、ハイスループット系を確立して受容体と結合する物質を探索する。スクリーニング対象は、組織抽出液、培養分泌細胞上清、ペプチドや化合物のライブラリー、さらには各種天然物ライブラリーとする。蛍光標識によりプローブとするリガンド側の結合能が変化しないことを確認する。そのため、合成ペプチドの性質が、蛍光標識の有無により変化するか、受容体結合実験や薬理実験で検証する。さらに、受容体-発光タンパク質と蛍光リガンドの相互作用を検出する。この系が機能していることを、まずV1b受容体-発光タンパク質と蛍光標識バゾプレッシンとの間で確認し、続いてオーファン受容体に適用する。また、既知のホルモン-受容体間の相互作用が検出されるか、コントロール実験として実施する。そのため、視床下部細胞から放出されるバゾプレッシンと下垂体のV1b受容体への結合を検出する。視床下部のバゾプレッシン産生細胞である室傍核や視索上核、あるいは下垂体後葉からペプチド分画を粗抽出し、蛍光標識バゾプレッシンと発光タンパク質融合V1b受容体の相互作用を競合阻害することを確認する。さらに精製されたバゾプレッシンをこの際の陽性コントロールとする。既に、V1b-発光タンパク質を強制発現させた場合に、十分発光が検出される発現量が得られることを確認している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
受容体の活性に依存しない探索により、新たなリガンド－受容体ペアを探索する方法を確立するため、発光タンパク質融合受容体の構築と強制発現実験を行ったところ、結果を当初の予想よりも低い経費で得ることが可能であったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
リガンドのスクリーニングに使用するコントロール実験のため、新たに受容体を追加することが可能となる。このためより安定したスクリーニングが可能である。
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