特異性の高い新規ユビキチンリガーゼ基質同定法の開発

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K15058
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 渡部 昌 北海道大学, 医学研究科, 助教 (10632424)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ユビキチン / ユビキチンリガーゼ

研究実績の概要

本研究で開発しているユビキチンリガーゼ（E3）基質同定法の手順は、１．プローブを作製し、２. プローブを細胞に安定発現させ、３. プローブが捕獲するユビキチンリガーゼの基質を抗FLAG抗体で免疫沈降し、４. トリプシンによって消化し、５. ユビキチンレムナント抗体（K-eGG抗体）の利用によりユビキチン化を受けたペプチドのみ再精製を行い、６. IonTrap-Orbitrap型質量分析器にて検出、という手順からなる。まず条件を検討する中で、下記の点に留意する必要があることが明らかとなった。①プローブを安定に発現する細胞を用いる必要がある。（多くのプローブで、一過性に過剰発現させた細胞では基質候補の同定に至らなかった）②E3とTUBEを融合させたプローブを用いる必要がある。（多くのプローブで、E3とTUBEを独立して用いると基質候補の同定に至らなかった）③E3とTUBEの最適な融合部位はそれぞれのE3によって異なりE3ごとに検討が必要である。④プローブの発現量に応じ、用いるサンプルの量を増減させる必要がある。
これらの留意点を踏まえて、現在まで２１のE3遺伝子についてプローブを作製し、プローブを安定に発現する細胞株の作製を試みた。このうち、１０のE3遺伝子プローブの安定発現株取得に成功し、６のE3遺伝子プローブで特異的と思われる基質候補分子とそのユビキチン化部位の同定に成功している。また、刺激依存的、刺激後の時間依存的な基質候補分子の同定にも成功している。

研究成果

• [雑誌論文] TRIM proteins and diseases. (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M and Hatakeyama S
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 161 ページ: 135-144
  • DOI: https://doi.org/10.1093/jb/mvw087
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Mizushima W, Takahashi H, Watanabe M, Kinugawa S, Matsushima S, Takada S, Yokota T, Furihata T, Matsumoto J, Tsuda M, Chiba I, Nagashima S, Yanagi S, Matsumoto M, Nakayama K, Tsutsui H, Hatakeyama S
  • 雑誌名: J. Mol. Cell. Cardiol. 巻: 100 ページ: 43-53
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.yjmcc.2016.09.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] p53 represses the transcription of snRNA genes by preventing the formation of little elongation complex. (2016)
  • 著者名/発表者名: Anwar D, Takahashi H, Watanabe M, Suzuki M, Fukuda S and Hatakeyama S
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta-Gene Regul. Mech. 巻: 1859 ページ: 975-982
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagrm.2016.06.001
  • 査読あり
• [学会発表] The E3 ubiquitin ligase TRIM23 regulates adipocyte differentiation via stabilization of the adipogenic activator PPARγ (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • 年月日: 2016-12-01
  • 招待講演
• [学会発表] ユビキチンリガーゼTRIM23は非定型ポリユビキチン化によるPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 東北大学川内北キャンパス （宮城県・仙台市）
  • 年月日: 2016-09-27
• [学会発表] ユビキチンE3リガーゼTRIM23は非定型ポリユビキチン化によるPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • 学会等名: 第68回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都府・京都市）
  • 年月日: 2016-06-15
• [学会発表] ユビキチンリガーゼTRIM23はPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • 学会等名: 第89回日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府・京都市）
  • 年月日: 2016-04-21
• [図書] Advances in Medicine and Biology. Volume 120 (2017)
  • 著者名/発表者名: Masashi Watanabe and Shigetsugu Hatakeyama
  • 総ページ数: 23
  • 出版者: Nova Science Publishers