2015 年度実施状況報告書

iPS細胞を用いたミトコンドリアDNA維持機構の破綻と神経変性への関与

研究課題

研究課題/領域番号	15K15083
研究機関	広島大学
研究代表者	森野豊之広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (10397953)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	遺伝子 / 脳神経疾患 / ミトコンドリア
研究実績の概要	われわれは，これまでに神経変性疾患の原因変異を同定し，その変異から病態機序を解明する研究を行ってきた．これまでに家族性ALSの新規原因遺伝子optineurinやPerrault症候群の新規原因遺伝子C10orf2などを同定してきた．本研究の目的は，Perrault症候群の新規原因遺伝子として同定したC10orf2の変異がミトコンドリアDNAの維持機構を障害し，神経細胞死にいたる過程を培養細胞レベルで再現することである．iPS細胞を樹立する際にミトコンドリアDNAの異常が初期化されることを利用して，患者由来iPS細胞を小脳プルキンエ細胞に分化させることで，実際の神経細胞内でミトコンドリアDNA異常が蓄積されていく様子を経時的に観察する．ミトコンドリアDNA異常は老化の観点からも重要であり，本研究の成果を応用することで，培養細胞での老化の評価を行うことができる可能性もある．本年度は，患者由来iPS細胞の樹立とコントロールiPS細胞の樹立を行った．コントロールのiPS細胞は未分化能も維持され形態学的にも問題はないが，患者由来iPS細胞では通常のiPS細胞に比べて未分化状態が不十分で不均一だった．原因としては，もともとの遺伝子異常が関係している可能性が考えられる．患者由来iPS細胞の未分化状態が不十分であったため，引き続きiPS細胞の樹立を行い，十分な系統の細胞株が得られたらミトコンドリアDNA異常の評価を行う予定である．
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 Yamanaka法に従って，患者から得られた線維芽細胞と正常対照から得られた線維芽細胞を用いてiPSの樹立を行った．未分化状態と神経細胞への分化誘導を行い，今後の解析に十分な細胞株を得るために免疫組織化学的に評価した．その結果，正常対照から樹立したiPS細胞は十分な未分化能と神経細胞への分化能を有していたが，患者由来のiPS細胞では未分化能が低く，神経細胞への分化も低頻度であった．原因としては，患者由来iPS細胞の樹立にもともとの遺伝子異常が影響している可能性が考えられた．本研究では，コントロールのiPS細胞として，患者由来iPS細胞を複数株樹立した後に，TALENあるいはCRISPR/Cas9システムを用いて原因となる変異を正常化したものを用いることにしており，引き続き解析に耐えうる十分な患者由来iPS細胞が得られるように樹立を継続して行っている．
今後の研究の推進方策	患者由来iPS細胞が十分確保された時点で，ミトコンドリアDNA異常の評価を行う．Perrault症候群におけるミトコンドリアDNA異常としては，欠失，量的減少，変異が認められるため，それぞれlong-rang PCR，定量PCR，次世代シーケンサを用いて解析する．また，神経細胞への分化はFGF2などの成長因子存在下でiPS細胞を培養することで行い，分化効率も評価する． Perrault症候群は失調症状が主たる症状として認められるため，上記の神経細胞分化に加えて小脳プルキンエ細胞への分化誘導も試みる．患者由来iPS細胞と遺伝子異常をゲノム編集技術で正常化したコントロールiPS細胞を用いて，継代を重ねながらミトコンドリアDNA異常の経時的な変化を観察する．さらに，小脳プルキンエ細胞への分化誘導を行った後に培養細胞レベルで生存率が変化するかを確認する．