| 研究課題/領域番号 |
15K15114
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| 研究機関 | 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究 |
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研究代表者 |
松村 耕治 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 共同利用研究施設, 講師 (30272610)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 多能性幹細胞 / 分化誘導 / 線維芽細胞 / 神経細胞 / 気道上皮 / ソーティング / 細胞分散 |
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| 研究実績の概要 |
奇形腫の作成、細胞単離: 未分化iPS細胞(1X10e6)を免疫不全マウス精巣へ移植して約8週後に奇形腫の摘出、細胞単離は、ハサミで細切後に溶血処理。新規に200umのナイロンメッシュも加えて1mm, 100um, 70umメッシュでよりつまりのない細胞回収が行われる様になった。
ソーテング及び培養：前年度までの神経系細胞: CD271 (神経堤)、 CD56 (NCAM、神経前駆)、間質細胞: 線維芽細胞抗体は追実験を行いデータの再現性が確認された。さらに、血管内皮細胞: CD31、CD144 (VE-Cadherin)、CD309 (VEGFR-2/KDR)のソーテングを試みるも、細胞数は1%以下と極めて少なく、内皮細胞用培養液（EMG-2）で培養するも内皮細胞は増殖しなかった。そこで、内皮細胞の前駆(未分化)細胞マーカーCD34でソーテングすると、10％以上の細胞分画が得られ、同培養液で1ヶ月培養後にCD31、CD144 (VE-Cadherin)陽性、CD34陰性の内皮細胞が認められた。血管内皮前駆細胞をソーティング後に細胞増殖、分化誘導が行われた。一方、上記抗体(CD144)でソーティングした神経系細胞をSFEBq法に準じた神経前駆細胞用培地(AMPKやBMPを阻害)で培養することで神経前駆細胞数が増加した。その後の分化誘導培地(purmorphamine添加など)で効率的に分化神経細胞が得られた。
新規表面マーカー：呼吸器上皮細胞(気道線毛)に対する表面マーカー(carboxypeptidase M)が本邦の研究者より報告されたので抗体を入手、奇形腫からの単離細胞内での細胞分画を解析したところ、1.5%であった。呼吸器上皮のソーティング、培養を行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
免疫不全マウスの奇形腫は、iPS細胞移植後にほぼ100%発症して組織型も実験毎にほぼ均一である。摘出した奇形腫組織からの細胞分散はメッシュの追加など行っているが、効率よくシングル細胞分散できる満足いく方法を得ていない。しかし、一つの奇形腫から組織検査用の組織塊を除き常に10e7個以上の数の生きた細胞が得られるため(細胞破片は多い)、ソーティングを含めた先の実験へ進めることができる。
17種類以上の分化細胞に特異的な抗体で陽性細胞をスクリーニングのためフローサイトメーター解析を行い、その中で3種類の抗体で、細胞取得、培養に成功した。神経前駆細胞は、1ヶ月以上の神経細胞特異的な培養液で神経突起の見られる神経細胞へ分化した。これは、本研究の目的の一つである。増殖する線維芽細胞も得られ、抗体で線維芽細胞であることの確認を行った。ヒトiPS細胞から分化した線維芽細胞を得ることは、in vitroにおいても論文報告は見られない。本研究の根本的な一連の手技(奇形腫→ソーティング→培養)は完成しつつある。
奇形腫の組織学的検索により血管内皮細胞の細胞が取得できる事を予想していたが、用いた分化抗体での陽性率は1%前後で少なく、また、ソーティング後の培養で細胞増殖が見られるが血管内皮細胞マーカーの発現は認められない。未分化血管内皮細胞(前駆細胞)であるCD34抗体によるソーティングは血管内皮細胞の取得に大いに寄与した。
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| 今後の研究の推進方策 |
呼吸器上皮細胞:新たに呼吸器上皮細胞(気道線毛)の表面抗体(anti-carboxypeptidase M)を入手したのでソーティングを試みる。予備実験でフローサイトメーターで解析したところ、奇形腫全体の浮遊細胞中の1.5%がanti-carboxypeptidase M抗体陽性であった。この分画をソーテング、呼吸器上皮専用培地(BEBM)で培養を試みる。この実験は、本学呼吸器内科の培養技術等の指導を受けながら推進する予定である。
適切な奇形腫形成: 本来の精巣部から外表部の形成を目的とするも、腹腔内に生じることが多く、水腫を伴いホストマウスを短命にする。水疱の少ない奇形腫を外表部に作成するために手術時に操作する精巣をなるべく元の精巣部に戻す。
細胞分散法: 効率の良い細胞分散のため、ハサミの細切に加え、ホモジナイズの操作法、コラゲナーゼ処理時間、等の処理を検討してより多くの生細胞を得られるよう検討する。
分化細胞: ソーティングして培養に成功した二種類の細胞以外にも可能な限り分化細胞の分取、培養を行う。本年度試みる気管支上皮は分化誘導の報告は1報である。
病態解明への応用: 線維芽細胞の分裂能の低下するウェルナー症候群由来のiPS細胞、いくつかの神経疾患のiPS細胞を理化学研究所細胞バンクより入手して奇形腫作成、神経細胞、線維芽細胞を分取培養してそれらの疾患の原因となる細胞より病態解明を行う。気管支細胞、上皮細胞などの分取培養がうまくいけば、他の多くの疾患で、in vitroでの培養が難しい疾患に応用が期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
全般的に、計画的な試薬の利用を考え、分注、凍結保存を頻回に行い、試薬を効率的に利用した。高価な抗体試薬は、少量に分注された抗体を購入した。神経、上皮に特異的な培地も比較的少ない量で済んだ。これは、ソーティングした細胞を48ウエルプレートなどで培養したので、少量で済んだ。ソーティング機器利用の試薬、緩衝液、未分化iPS細胞の培養、維持は以前の科研費で購入した残存試薬でほぼ代用できた。ナイロンメッシュフィルターはナイロン布を購入して手作りで行った。リアルタイムPCRの遺伝子検査を予定していたが到達しなかった。免疫不全マウスで計画的に移植して奇形腫を作る際も、3ヶ月必要で、一度に多くはマウスを利用できなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
さらに新規あるいは既存の抗体を購入する。血管内皮細胞、神経系細胞の抗体の他、分化した神経細胞マーカー(choline)、気管支、消化管上皮など少量で購入できない高価な抗体を予定している。免疫不全マウスも60匹以上を予定しているが、高価である。BDNFなどの神経分化因子、気管支や上皮細胞の分化因子の含まれた特異的な培地も予定していいる。分化した細胞の遺伝子発現解析のため、Taqman PCRプローブ、関連試薬、理化学研究所への疾患特異的iPS細胞の入手にも利用する予定である。論文による発表も行う。
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