| 研究課題/領域番号 |
15K15249
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| 研究機関 | 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所 |
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研究代表者 |
吉光 真人 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 衛生化学部, 主任研究員 (70321940)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ブドウ球菌エンテロトキシン / SEs / LC-MS/MS / 消化 / ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
黄色ブドウ球菌エンテロトキシン(SEs)には食中毒の原因となる11種の抗原型が存在する。本研究では、質量分析計をSEs測定に導入し、食中毒の原因となるSEs全11種を定量することで、SEs食中毒の実態を解明することを目的としている。
本年度は、前年度に確立した市販黄色ブドウ球菌エンテロトキシン(SEs)6種類の一斉分析法を用いて、牛乳およびブレインハートインフュージョン(BHI)培地に含まれるSEsの前処理法および機器分析条件を検討した。その結果、牛乳ではカゼインおよび脂質の除去処理後、限外ろ過スピンカラムを用いて濃縮する前処理法、BHI培地培養上清では限外ろ過スピンカラムを用いて濃縮する前処理法が有効であった。その後、還元アルキル化処理、トリプシン消化を行い、LCMSMSを用いてそれぞれのSEsに特異的なペプチドをMRM分析した。その分析結果から、試料ごとに適した測定対象ペプチドとMRMトランジションを決定した。
また、測定対象ペプチドの感度を向上させるため、消化酵素の種類や濃度、還元アルキル化条件の検討、消化後の溶液の精製、濃縮を検討した。消化酵素や還元アルキル化条件では、本分析法で用いている手法よりも良好な結果を示すものは見られなかった。消化後の溶液の精製、濃縮では、固相カートリッジカラムを用いて精製し、遠心エバポレータで濃縮乾固後、測定溶媒に溶解する手法が良好な結果を示した。精製、濃縮を行うことで、測定対象ペプチドの感度を10倍程度向上することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在、ブドウ球菌培養上清(BHI培地培養上清)および牛乳中の、市販SEs分析法を確立途上である。分析法確立後、免疫学的検出法との比較を実施する。また、毒素が市販されていないSEsについて、PC上での分析条件は設定したが、実試料での検討には毒素が必要なため、未実施である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度、まず分析法の消化時間短縮の検討を行う。現在16時間行っている消化時間の短縮が可能であれば、迅速にSEsを検出、定量することが可能な手法を確立できる。また、消化率を補正する方法を検討する。水溶液と比較し、牛乳やBHI培地培養上清ではSEsが消化される割合が低下する。そこで、試料と同様に、検量線用標準溶液も牛乳や培養上清へ添加、前処理、消化、精製を行い、検量線を調製する手法を検討する。
以上から、牛乳、BHI培地培養上清中のSEs分析法を確立し、確立した分析法の妥当性確認試験を行う。その後、確立した分析法および免疫学的検出法で陽性検体を分析し、結果を比較する。これらの結果をまとめて雑誌へ投稿する予定である。
また、毒素が市販されていないSEsについて、リコンビナントタンパクを作製し、実試料での検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）本年度は市販SEs分析法を確立途上である。また、免疫学的手法との比較、市販品のないSEs5種の分析法の検討等が未実施であった。そのため、支出額が抑制され、次年度使用額が生じた。
（使用計画）次年度に、牛乳、BHI培地培養上清中のSEs分析法を確立し、確立した分析法の妥当性確認試験を行う。その後、確立した分析法および免疫学的検出法で陽性検体を分析し、結果を比較する。これらの結果をまとめて雑誌へ投稿する予定である。また、毒素が市販されていないSEsについて、リコンビナントタンパクを作製し、実試料での検討を行う予定である。以上の研究計画を遂行することで、次年度使用額は適正に執行可能である。
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