研究課題
本研究は申請者らがこれまで見出してきた「腸管粘膜の免疫恒常性は上皮細胞内のオートファジーと粘膜内リンパ球間における連鎖・協調によって制御される」という独自の概念や知見を基盤として、腸管上皮細胞と粘膜内T細胞あるいはB細胞とのクロストーク、およびそれによる粘膜内の特異的免疫調節機構における分子メカニズムについて着目している。その結果、本研究では当該研究期間に以下のような成果が得られた。１）野生型C57BL6マウスの大腸組織から上皮細胞を単離し、長期培養系を樹立させた。２）ここに阻害薬によってオートファジーを阻害しつつ、継代培養を継続できる条件を見出した。３）これらの培養上皮細胞から蛋白質を抽出し生化学的解析を行った結果、LC-3Ⅱの発現が抑制されていることやp62の発現が上昇していることを確認した。４）一方、これらの培養上皮細胞にレトロウイルスベクターGFP-RVおよびDsRed-RVを用いて遺伝子を導入しつつ、継代培養を継続できる条件を確認した。５）さらに、マウスから単離したT細胞を上記の培養上皮細胞と共培養する条件を見出した。これらの研究成果は生理的な条件下における正常腸管上皮細胞のオートファジー機能をin vitroで詳細に解析できる可能性、またその条件下における免疫学的解析も可能であることを示唆する。さらに現在、このメカニズムが関連すると考えられるその他の遺伝子発現に着目し、その解析を進めている。
2: おおむね順調に進展している
腸管粘膜の免疫調節機構は上皮細胞とリンパ球のクロストークが根幹にあり、上皮細胞のオートファジーがその中枢を担っていることに着目しているが、今回マウス大腸組織由来の正常上皮細胞培養系を用いたin vitroにおけるオートファジー阻害解析系を樹立できたこと、およびその解析結果から新たな現象を見出すことが出来たことは大きな成果であるといえる。
次年度は細胞間クロストークにおけるこの分子メカニズムに着目し、これをさらに詳細に解析するためにin vitroおよびex vivo実験系ではウイルスベクターによる培養細胞への遺伝子導入、分子生物学的解析、またin vivo実験系では遺伝子改変動物における疾患モデルの誘導とその臨床および病理学的解析、フローサイトメトリー、サイトカイン測定、また免疫組織染色などを行う予定である。
試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。
検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 謝辞記載あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 4件)
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