コラーゲン遺伝子異常による心臓刺激伝導障害の新たな分子病態の解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K15311
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 蒔田 直昌 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (00312356)
• 研究分担者: 牧山 武 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30528302)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: コラーゲン / 進行性心臓伝導障害 / CRISPR/CAS / ノックインマウス

研究実績の概要

1. Purkinje線維標識マウス心筋におけるCOL6A2の局在・経年変化
Purkinje線維に特異的に発現するContactin2-EGFP融合タンパクのトランスジェニックマウス(cntn2-EGFP)を、胎生12日から生後1か月まで左室横断切片を作成し、VI型コラーゲンを免疫組織染色した。胎生時にはVI型コラーゲンは心室筋細胞の全層にわたって発現していたが、年齢依存性に心内膜側に集族するようになり、生後１月ではcontactin2と同様、ほぼ刺激伝導系に強く発現していた。単離心筋細胞でもVI型コラーゲンは、細胞外的リックスとして心筋細胞周囲に発現していた。RNAレベルでも、COL6AのRNA発現量は心室筋細胞よりも伝導系細胞で強かった。
2. 進行性心臓伝導障害(PCCD)の網羅的遺伝子解析
４世代にわたる日本人PCCD家系のうち罹患者3人・非罹患者２人の全エクソン解析を行った。各種公的バリエーションデータベースでフィルタリングしたところ、COL6A2, TTN(タイチン), NUPL2(ヌクレオポリン2)の変異が家系内で臨床像と合致していた。さらに、日本人PCCD 53家系に関して、上の３つの遺伝子を含む200遺伝子のターゲットエクソン解析を行ったところ、LMNA(ラミンA/C)16人、SCN5A(心筋Naチャネル)11人、COL6A2 2人、その他の遺伝子6人に変異が同定された。COL6A2はPCCDの新たな疾患遺伝子である可能性が高くなった。
3.CRISPR/Casシステムを用いたCOL6A2ノックインマウスの作成
CRISPR/Casシステムを用いて上記PCCD家系に同定されたCOL66A2-変異P402Aノックインマウスを作製した。21日後産仔のジェノタイピング行い、オフターゲット解析で配列異常がないものをファウンダー(F0)とし、さらに野生型個体との戻し交配を行って生殖系列伝達を確認する。現在F2世代のホモを繁殖中で、今後心電図を含め電気生理学的にPCCDとしての表現型がないかどうかを検討する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1. COL6A2が刺激伝導系細胞周囲の細胞外マトリックスとして発現分布していることを、刺激伝導系細胞を標識したトランスジェニックマウスを使い証明した。
2. 全エクソン解析、ターゲットエクソン解析によってPCCD患者の網羅的遺伝子解析を行い、COL6A2がPCCDの原因遺伝子であることを確実にした。
3. COL6A2-P402Aのノックインマウスを樹立し、近々機能評価を行う。

今後の研究の推進方策

1. COL6A2-P402AのノックインマウスのIn vivo解析を行う。
2. PCCD患者からiPS心筋細胞を樹立し、刺激伝導障害メカニズムをin vitroで解析する予定である。

次年度使用額が生じた理由

1. COL6A2-P402AのノックインマウスのIn vivo解析を行うため。
2. PCCD患者からiPS心筋細胞を樹立し、機能解析するため。

次年度使用額の使用計画

1. COL6A2-P402AのノックインマウスのIn vivo解析を行う。
2. PCCD患者からiPS心筋細胞を樹立し、刺激伝導障害メカニズムをin vitroで解析する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] INSERM/CNRS(フランス)
  • 国名: フランス
  • 外国機関名: INSERM/CNRS
• [雑誌論文] Targeted resequencing identifies TRPM4 as a major gene predisposing to progressive familial heart block type I. (2016)
  • 著者名/発表者名: Daumy X, Amarouch MY, Lindenbaum P, Bonnaud S, Charpentier E, Bianchi B, Nafzger S, Baron E, Fouchard S, Thollet A, Kyndt F, Barc J, Le Scouarnec S, Makita N, Le Marec H, Dina C, Gourraud JB, Probst V, Abriel H, Redon R, Schott JJ.
  • 雑誌名: Int J Cardiol 巻: 207 ページ: 349-358
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2016.01.052
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Novel mutation in the alpha-myosin heavy chain gene is associated with sick sinus syndrome. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T, Jou CJ, Nogami A, Kowase S, Arrington CB, Barnett SM, Harrell DT, Arimura T, Tsuji Y, Kimura A, Makita N
  • 雑誌名: Circ Arrhythm Electrophysiol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1161/CIRCEP.114.002534
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Inherited bradyarrhythmia: A diverse genetic background. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T, Tsuji Y, Makita N
  • 雑誌名: Journal of Arrhythmia 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.joa.2015.09.009
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cardiac sodium channel mutation associated with epinephrine-induced QT prolongation and sinus node dysfunction. (2016)
  • 著者名/発表者名: Chen J, Makiyama T, Wuriyanghai Y, Ohno S, Sasaki K, Hayano M, Harita T, Nishiuchi S, Yuta Yamamoto, Ueyama T, Shimizu A, Horie M, Kimura T.
  • 雑誌名: Heart Rhythm 巻: 13(1) ページ: 289-98
  • DOI: 10.1016/j.hrthm.2015.08.021.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The genetics underlying acquired long QT syndrome: impact for genetic screening. (2016)
  • 著者名/発表者名: Itoh H, Crotti L, Aiba T, Spazzolini C, Denjoy I, Fressart V, Hayashi K, Nakajima T, Ohno S, Makiyama T, Wu J, Hasegawa K, Mastantuono E, Dagradi F, Pedrazzini M, Yamagishi M, Berthet M, Murakami Y, Shimizu W, Guicheney P, Schwartz PJ, Horie M
  • 雑誌名: Eur Heart J 巻: 37(18) ページ: 1456-64.
  • DOI: 10.1093/eurheartj/ehv695
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Asymmetry of parental origin in long QT syndrome: preferential maternal transmission of KCNQ1 variants linked to channel dysfunction (2016)
  • 著者名/発表者名: Itoh H, Berthet M, Fressart V, Denjoy I, Maugenre S, Klug D, Mizusawa Y, Makiyama T, Hofman N, Stallmeyer B, Zumhagen S, Shimizu W, Wilde AA, Schulze-Bahr E, Horie M, Tezenas du Montcel S, Guicheney P.
  • 雑誌名: Eur J Hum Genet. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1038/ejhg.2015.257.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] LMNA cardiomyopathy detected in Japanese arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy cohort. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kato K, Takahashi N, Fujii Y, Umehara A, Nishiuchi S, Makiyama T, Ohno S, Horie M
  • 雑誌名: J Cardiol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.jjcc.2015.10.013.
• [雑誌論文] Novel SCN10A variants associated with Brugada syndrome (2016)
  • 著者名/発表者名: Fukuyama M, Ohno S, Makiyama T, Horie M
  • 雑誌名: Europace. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1093/cvr/cvv042
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genotype-dependent differences in age of manifestation and arrhythmia complications in short QT syndrome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Harrell DT, Ashihara T, Ishikawa T, Tominaga I, Mazzanti A, Takahashi K, Oginosawa Y, Abe H, Maemura K, Sumitomo N, Uno K, Takano M, Priori SG, Makita N.
  • 雑誌名: Int J Cardiol 巻: 190 ページ: 1095-1104
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2015.04.090
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Functional Characterization of Rare Variants Implicated in Susceptibility to Lone Atrial Fibrillation (2015)
  • 著者名/発表者名: Hayashi K, Konno T, Tada H, Tani S, Liu L, Fujino N, Nohara A, Hodatsu A, Tsuda T, Tanaka Y, Kawashiri MA, Ino H, Makita N, Yamagishi M.
  • 雑誌名: Circ Arrhythm Electrophysiol 巻: 8(5) ページ: 1095-1104
  • DOI: 10.1161/CIRCEP.114.002519
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Mechanisms Underlying Urate-Induced Enhancement of Kv1.5 Channel Expression in HL-1 Atrial Myocytes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Maharani N, Ting YK, Cheng J, Hasegawa A, Kurata Y, Li P, Nakayama Y, Ninomiya H, Ikeda N, Morikawa K, Yamamoto K, Makita N, Yamashita T, Shirayoshi Y, Hisatome I.
  • 雑誌名: Circ J 巻: 79(2) ページ: 2659-2668
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-15-0416
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Fibrosis, Connexin-43, and Conduction Abnormalities in the Brugada Syndrome (2015)
  • 著者名/発表者名: Nademanee K, Raju H, de Noronha SV, Papadakis M, Robinson L, Rothery S, Makita N, Kowase S, Boonmee N, Vitayakritsirikul V, Ratanarapee S, Sharma S, van der Wal AC, Christiansen M, Tan HL, Wilde AA, Nogami A, Sheppard MN, Veerakul G, Behr ER
  • 雑誌名: J Am Coll Cardiol 巻: 66(18) ページ: 1976-1986
  • DOI: 10.1016/j.jacc.2015.08.862
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Electrophysiological Features of Patient-specific Human-induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes Carrying the SCN5A-D1275N Mutation (2016)
  • 著者名/発表者名: 早野 護、牧山 武
  • 学会等名: 日本循環器学会
  • 発表場所: 仙台、仙台国際会議場
  • 年月日: 2016-03-18
• [学会発表] SCN5A and ventricular arrhythmias. (2015)
  • 著者名/発表者名: Makita N
  • 学会等名: Asian Pacific Heart Rhythm Society
  • 発表場所: Melbourne, Australia.
  • 年月日: 2015-11-22
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Cardiac Sodium Channel Mutation Associated With Epinephrine-Induced QT Prolongation and Sinus Node Dysfunction, (2015)
  • 著者名/発表者名: 陳 嘉容、牧山 武
  • 学会等名: 日本不整脈学会／日本心電学会
  • 発表場所: 京都、京都国際会議場
  • 年月日: 2015-07-28
• [学会発表] New genes for Progressive Cardiac Conduction Disease (2015)
  • 著者名/発表者名: Makita N
  • 学会等名: Heart Rhythm Society
  • 発表場所: Boston,USA.
  • 年月日: 2015-05-14
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural and Electrophysiological Characteristic of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes, (2015)
  • 著者名/発表者名: 牧山 武
  • 学会等名: 日本循環器学会
  • 発表場所: 大阪、大阪国際会議場
  • 年月日: 2015-04-24
  • 招待講演
• [学会発表] Genetic Backgrounds of Patients with Clinically Diagnosed Idiopathic Ventricular Fibrillation (2015)
  • 著者名/発表者名: 糀谷 泰彦、牧山 武
  • 学会等名: 日本循環器学会
  • 発表場所: 大阪、大阪国際会議場
  • 年月日: 2015-04-24
• [図書] 不整脈診療クリニカルクエスチョン200 (2015)
  • 著者名/発表者名: 蒔田直昌
  • 総ページ数: 333
  • 出版者: 診断と治療社
• [図書] 不整脈症候群 (2015)
  • 著者名/発表者名: 蒔田直昌
  • 総ページ数: 196
  • 出版者: 南江堂