研究課題
1. 心筋誘導化合物によるマウス心筋直接リプログラミング(1) 心筋誘導を促進する化合物のスクリーニングと心筋誘導化合物の同定マウス線維芽細胞から拍動する心筋細胞誘導を促進する化合物を同定するため、これまで幹細胞からの心筋誘導、iPS細胞作製において高い効果を示した小分子化合物をスクリーニングした。Gata4/Mef2c/Tbx5(GMT)を遺伝子導入し、翌日から培養液を無血清培地に変え8化合物をスクリーニングして4週後に拍動心筋の数を計測した。その結果、FGF2, FGF10, VEGFで拍動心筋誘導を促進した。さらにその3つの増殖因子(FGF2, FGF10, VEGF)をさまざまな組み合わせで投与したところ、3化合物すべてを同時に投与した群で顕著に心筋誘導が改善した。また時間経過をみたところ、既存の血清を用いる方法に比べて早期より心筋拍動が見られ、最終的に拍動する心筋の数は約40倍増加した。化合物FFV添加を用いて得られる誘導心筋細胞を免疫染色法で確認したところする、様々な心筋蛋白の発現と横紋構造形成を有する心筋細胞の作製を確認できた。(2) 心筋誘導化合物FFVによるリプログラミング改善のメカニズム解析次に化合物による心筋リプログラミング改善の分子メカニズムを解析した。1. 血清入り培地群、2. 無血清培地群、3. 無血清培地/FFV添加群の３群にわけて遺伝子の発現変化をマイクロアレイで解析した。また細胞拍動開始前後の2,4週で遺伝子発現を比較し、その間で変化する遺伝子群をGO term解析やPathway解析で評価した。その結果、FFV添加群で4週で548遺伝子が他の群に比べて優位に上昇していた。さらにGO term解析の結果、それらはイオンチャネル、トランスポーター、心筋収縮関連遺伝子など心臓機能に関与する遺伝子群が上昇していることがわかった。
2: おおむね順調に進展している
心筋誘導を促進する化合物を同定し、さらにそのメカニズムの一端を明らかにできた。
化合物を用いて心筋誘導転写因子を減らせるか検討する。さらに心筋誘導化合物によるヒト心筋直接リプログラミング促進効果を検討する。
平成27年度に遺伝子を減らす実験を行う予定であったが、検体が十分に集まらずに細胞誘導実験と解析を次年度に行うこととした。
遺伝子を減らして作成する誘導心筋細胞の遺伝子解析、タンパク発現、機能解析を行う予定である。
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