病変組織に沈着した免疫複合体の網羅的解析法の開発と自己免疫疾患の組織解析への応用

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K15373
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 大山 要 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (50437860)
• 研究分担者: 川上 純 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (90325639) ; 中村 英樹 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (10437832)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 免疫複合体

研究実績の概要

自己免疫疾患では血液中を循環する免疫複合体 (IC) が組織に沈着し、炎症と組織障害を起こすと考えられてきた。しかし、「どのような自己抗原を含む IC が病変組織に沈着しているのか」を調べるには、自己抗原候補を1つ1つ対応抗体で免疫組織染色するしかなく、探索効率が非常に悪い。そのため、ほとんどの疾患で沈着 IC の自己抗原は特定されていない。本研究では、沈着 IC を形成する自己抗原と自己抗体を組織から抽出した後、IC を再構成させ、IC 中の自己抗原を独自解析法で同定する、「沈着 IC の網羅的解析法」を完成させる。
皮膚組織にミオグロビン-抗ミオグロビン抗体複合体（モデル免疫複合体）を添加・乾燥した試料をホルムアルデヒドに一晩浸してモデル組織を作製した。これまでの検討結果をもとに、リン酸緩衝液に浸したモデル組織を電子レンジ（500W）で5分加熱して抗原賦活化し、液体窒素凍結と破砕を行った後、界面活性剤CHAPSで免疫複合体を含むタンパク質を抽出し、CHAPSを除去するために透析を行った。透析後、抗原賦活化されたミオグロビン抗原とミオグロビン抗体について試験管内で免疫複合体を再構成した後、Protein G固定化磁気ビーズ・トリプシン消化で得られたペプチドのMS/MS分析でミオグロビンが検出されるかを検証した。過去の検討で最適化された条件下でも、ミオグロビンを検出することはできなかった。
本研究の結果から、組織で変性している抗原の抗原賦活化が予想よりも効率が悪く、抽出後の再構成が進まないことがわかった。今後は組織表面から直接分析する、liquid extraction surface analysisなどの表面MS分析を駆使した免疫複合体の組織解析を検討する方向で方針変更が必要と思われる。

研究成果

• [雑誌論文] Immuno complexome analysis of antigens in circulating immune complexes from patients with acute cellular rejection after living donor liver transplantation. (2018)
  • 著者名/発表者名: N. Aibara, K. Ohyama, M. Hidaka, N. Kishikawa, Y. Miyata, M. Takatsuki, S. Eguchi, N. Kuroda
  • 雑誌名: Transplant Immunology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.trim.2018.02.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel anti-suprabasin antibodies may contribute to the pathogenesis of neuropsychiatric systemic lupus erythematosus. (2018)
  • 著者名/発表者名: K. Ichinose, K. Ohyama, K. Furukawa, O. Higuchi, A. Mukaino, K. Satoh, S. Nakane, T. Shimizu, M. Umeda, S. Fukui, A. Nishino, H. Nakajima, T. Koga, S. Kawashiri, N. Iwamoto, M. Tamai, H. Nakamura, T. Origuchi, M. Yoshida, N. Kuroda, A. Kawakami
  • 雑誌名: Clinical Immunology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.clim.2017.11.006
  • 査読あり
• [学会発表] 強みを生かせばできる！基礎-臨床双方向の研究展開 (2018)
  • 著者名/発表者名: 大山 要
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会
  • 招待講演
• [学会発表] イムノコンプレキソーム解析法における免疫複合体抗原選択的な溶出法の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 相原希美，蒲原千裕，Anil Chauhan，岸川直哉，中嶋幹郎，黒田直敬，大山 要
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会
• [学会発表] 抗体医薬品の薬効実態の評価につながる実効薬物濃度測定法の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 田中結唯，大山 要，山田靖子，中嶋弥穂子，中嶋幹郎
  • 学会等名: 第34回日本薬学会九州支部大会
• [学会発表] 生体肝移植後、急性拒絶症例における免疫複合体（イムノコンプレックス）の特徴 (2017)
  • 著者名/発表者名: 日高匡章，大山 要，相原希美，曽山明彦，足立智彦，大野慎一郎，原 貴信，岡田怜美，濱田隆志，金高賢悟，高槻光寿，江口 晋
  • 学会等名: 第53回日本移植学会